單寧酸通過內質網應激途徑增強順鉑抗肝癌細胞HepG2的作用

耿娜娜，吳明松,，鄭 翔，楊 蕾，王宏陽，李學英△

(1.遵義醫學院口腔學院，貴州遵義 563000；2.貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室/遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州遵義 563000；3.遵義醫學院醫學遺傳學教研室，貴州遵義 563000)

有研究顯示，2015年中國肝癌男女新發病分別為343 700例和122 300例，其中男性死亡310 600例，女性死亡111 500例，占癌癥相關死因的17.2 %和11.1 %[1]。原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)在我國發病率較高，其中肝細胞癌(hepatic carcinoma，HCC)占PLC的90%以上[2-3]。順鉑(cis-dichlorodiamine platinum，CDDP)是治療HCC的主要藥物之一，但其單藥有效率比較低[3]，毒副作用也較大。研究表明，單寧酸(tannic acid，TA)可與其他藥物協同發揮抗癌作用，如與絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶聯用抗膽管癌[4]，與三氧化二砷(As2O3)聯用抗人類白血病[5]，與CDDP聯用抗卵巢癌[6]等。此外，TA能夠抑制人肝癌HepG2細胞的生長增殖[7-9]，但其分子機制尚不清楚。有研究表明口服TA較為安全，并被作為食品添加物[6]。因此，TA可能作為一種低毒的化療藥物增敏藥物，參與癌癥的預防和治療。

內質網主要負責蛋白質的合成、修飾與轉運、信號轉導等，當這些過程受到干擾時，會導致蛋白質的折疊、翻譯后修飾、基因表達等發生紊亂，從而引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[10]。ERS介導的細胞凋亡與眾多癌癥的發生、發展等有關聯[11-12]。研究表明，CDDP能夠通過激活ERS促進肝癌HepG2細胞的凋亡[13]。TA是否能夠協同增強CDDP抗肝癌，并通過ERS途徑誘導肝癌細胞凋亡，尚少見報道。本研究旨在探討TA協同增強CDDP抗肝癌HepG2細胞的作用，并通過體外實驗探索ERS凋亡通路在該協同效應中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株HepG2，來源于中國科學院細胞庫。TA(C76H52O46，含量大于或等于95%)購自Sigma公司，CDDP注射液[Cl2(NH3)2Pt]購自山東齊魯制藥公司，RPMI-1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技有限公司，噻唑藍(MTT)購自BBI公司，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Biosharp公司，M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司，dNTP Mix(10 mmol/L)購自上海生工生物公司，RNAiso TM Plus購自TaKaRa Biotechnology公司，PCR引物(表1)由上海生工生物公司合成，Sso Fast Eva Green supermix實時熒光定量PCR(q-RT-PCR)試劑盒購自Bio-Rad公司，鼠抗人葡萄糖調節蛋白(glucose regulated protein，GRP)94單抗、兔抗人GRP78多抗和兔抗人β-actin單抗、辣根過氧化物酶標記的多抗均購自Protein-Tech Group公司。酶標儀Model 680、PCR儀CFX Connect TM Optics Module均購自Bio-Rad公司，倒置熒光顯微鏡IX73購自Olympus公司，超微量分光光度計Nanodrop 2000購自Thermo Scientific公司，GOLD-SIM二氧化碳培養箱購自西盟國際公司。

表1 PCR引物序列及擴增長度

1.2方法

1.2.1細胞培養 將人肝癌細胞系HepG2培養于含10% FBS、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，每2～3 天傳代1次。

1.2.2細胞的生長抑制作用 采用MTT法檢測并計算細胞的存活率[14]。取對數生長期HepG2細胞接種于96孔培養板中，每孔1×104個。靜置培養24 h后，分別加TA 0(對照組)、90.00、180.00、270.00、360.00、450.00、540.00 μmol/L和CDDP 0(對照組)、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 μg/mL，每組設5個復孔。繼續培養24 h后，每孔加入10.00 μL濃度為5.00 mg/mL 的MTT溶液；再培養4 h后，棄上清液，每孔中加入100.00 μL二甲基亞砜，輕輕振蕩10 min。用酶標儀測定570 nm波長下各樣品的吸光度(A)值，各復孔的A取平均值，計算細胞的存活率，其中空白對照組細胞存活率記為100%。用等效線圖解法觀察TA和CDDP的協同作用，其中等效線圖中的斜線為兩種藥物聯合產生100%最大抑制效應時的相加等效線，當二者的劑量比例點位于等效線上時，表現為相加作用；位于等效線下方，表現為協同作用；位于等效線上方，表現為拮抗作用。藥物的協同作用還可通過藥物聯合作用指數(combination index，CI)和藥物劑量降低指數(dose reduction index，DRI)來判斷[15]。以(D)1和(D)2表示兩種藥物聯用達到某一特定生長抑制率時的使用濃度；(DX)1和(DX)2表示達到與聯合用藥相同的生長抑制率時，兩種藥物單獨使用的濃度。CI<1表明藥物具有協同作用；CI=1表明藥物具有相加作用；CI>1表明藥物具有拮抗作用。DRI表示在給定的抑制率下，與藥物單獨使用相比較，藥物聯合使用達到同一抑制率時，藥物劑量所降低的倍數。計算公式如下：

細胞存活率(%)=(實驗組A值-陰性對照組A值)/(空白對照組A值-陰性對照組A值)

(1)

CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2

(2)

(DRI)1=(DX)1/(D)1

(3)

(DRI)2=(DX)2/(D)2

(4)

1.2.3細胞形態與細胞核變化的觀察 DAPI是一種能夠穿透細胞膜與核DNA結合的熒光染料，可用于檢測細胞核的形態變化和細胞凋亡，正常的細胞核較為完整，染色質均勻；而凋亡細胞的染色質發生固縮，邊緣化，嚴重時發生細胞核裂解，產生核碎片等。取對數期HepG2細胞接種于6孔板，每孔3×105個(接種約3.00 mL)。藥物處理24 h后，經丙酮固定，DAPI染色后，于顯微鏡下觀察細胞和細胞核的形態，并照相。

1.2.4q-RT-PCR檢測 藥物處理24 h后，收集細胞，提取細胞總RNA，根據試劑盒方法，逆轉錄合成cDNA。q-RT-PCR反應體系體積為10.00 μL，包括cDNA 1.00 μL、Sso Fast Eva Green supermix 5.00 μL，上游引物0.50 μL，下游引物0.50 μL，無菌水3.00 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性60 s；95 ℃變性20 s，56 ℃(GRP78和β-actin)或63.5 ℃(GRP94)退火30 s，40個循環周期。每個樣品設置3管重復。以β-actin作為內參，采用2-△△CT的方法，用3次重復的平均值計算基因相對表達量。

1.2.5Western blot檢測 藥物處理24 h后，提取細胞總蛋白質，采用BCA法測定蛋白質的濃度，取一定體積量蛋白樣品，進行變性、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗(GRP78 1∶2 000；GRP94 1∶2 000；β-actin 1∶10 000)和二抗(1∶2 000)、曝光與顯影，晾干。

2 結 果

2.1TA與CDDP協同抑制肝癌細胞生長 TA和CDDP均能明顯抑制HepG2細胞的存活率，且均呈劑量性依賴(P<0.01)，TA和CDDP的半數抑制率(IC50)濃度分別為360.00 μmol/L(TA組，圖1A)和1.80 μg/mL(CDDP組，圖1B)。采用兩種藥物IC50一半濃度的方法聯合處理HepG2細胞，TA、CDDP組對HepG2的抑制率分別為(19.10±6.00)%、(17.50±4.00)%，而TA 360.00 μmol/L+CDDP 1.80 μg/mL(聯合組)抑制率為(60.30±2.00)%，明顯高于TA、 CDDP組(P<0.01)，見圖1C。等效線圖中TA與CDDP的劑量比例點絕大多數位于等效線下方(圖1D)。不同劑量的TA與CDDP聯用產生的抑制率為9.00%～70.00%(IC9～IC70)時，其CI分別為0.44、0.48、0.70、0.75、1.35，大多數均小于1；不同比例的TA與CDDP聯用的DRI分為1.40～4.00和1.60～5.30，見表2。

A:單純TA；B：單純CDDP;C:二者聯用；D：規范化等效線圖解法；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組(0)比較；c：P<0.01，與聯合組比較

圖1不同劑量TA與CDDP對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用

圖2 各組肝癌HepG2細胞的形態及細胞核變化

表2 TA與CDDP的CI與DRI情況

2.2TA增加CDDP的促肝癌細胞凋亡作用 凋亡細胞的基本形態變化主要有：細胞體變小、變圓，連接消失，與周圍的細胞脫離，細胞質濃縮，折光度降低等。藥物處理24 h后，對照組細胞貼壁良好，呈梭形或多角形，輪廓較為清晰，折光度均一；TA、CDDP組部分細胞開始脫壁，細胞體積皺縮、變圓，折光度降低；聯合組出現大量脫壁死亡細胞和細胞碎片，折光度明顯降低。藥物處理24 h后DAPI染色顯示，對照組細胞核較為完整，為橢圓形或圓形，染色質較為均勻，呈淡藍色；TA組、CP組部分細胞核固縮，出現大小不同的核裂解碎片(凋亡小體)；而聯合組多數細胞核固縮，細胞染色質聚集，部分細胞核邊緣呈現不規則，染色較深，呈現藍色熒光，出現更多的凋亡小體，表現出典型的細胞凋亡形態學變化，見圖2。

2.3TA與CDDP協同上調肝癌細胞ERS水平 藥物處理24 h后，聯合組細胞GRP78、GRP94 mRNA及蛋白的表達量明顯高于TA、CDDP組(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組GRP78、GRP94 mRNA及蛋白水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，c：P<0.05，與聯合組比較

圖3 各組肝癌HepG2細胞GRP78和GRP94蛋白表達

3 討 論

本研究發現TA與CDDP單獨用藥均能夠抑制HepG2細胞的生長增殖，且均呈劑量性依賴；當使用二者IC50的一半濃度進行聯合用藥后，上述效應加劇，抑制率明顯高于各單藥組，表明TA與CDDP具有協同抗HepG2的作用。等效線圖解法、CI、DRI，細胞及細胞核的形態學觀察結果進一步證明了二者的協同作用。已有研究表明，藥物產生的毒副作用主要與用藥劑量密切相關，因此通過降低藥物使用劑量能夠降低其毒副作用[16]，TA與CDDP 的協同抑制HepG2細胞的作用，能夠降低CDDP的使用劑量，減少其毒副作用，并且TA本身毒性較低，可作為CDDP的增敏藥物，參與癌癥的預防和治療，作者認為TA具有潛在的臨床應用價值。

當環境因素極大地擾亂內質網動態平衡的過程時，內質網將進行應激，并激活各種ERS反應。一方面，內質網會啟動各種調節機制以減輕這些損傷，使細胞適應環境的脅迫，以促進細胞的存活；另一方面，如果細胞無法適應環境的脅迫，長時間的ERS將會引起細胞凋亡的發生[17-18]。GRP78和GRP94是內質網蛋白的分子伴侶，被認為是ERS的標志性分子。GRP78，即相對分子質量為78×103調節血糖的蛋白，也被稱為ERS傳感器結合免疫球蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)。GRP94是另一種主要的GRP，相對分子質量為94×103。在非ERS狀態下，GRP78與蛋白激酶RNA樣內質網激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)、激活轉錄因子6(ATF6)形成穩定的配合物，并保持無活性狀態[19]。GRP78通過阻止PERK和IRE1α二聚體的形成，來抑制其活性[19]；與ATF6結合阻斷高爾基體定位信號，使ATF6穩定結合在內質網膜，阻止ATF6的進一步激活[20]。在ERS狀態下，內質網中積累的錯誤折疊蛋白與GRP78蛋白競爭，使GRP78從PERK、IRE1α和ATF6 上解離，從而失去其抑制作用，引起下游相關信號轉導[20]。

ERS介導的細胞凋亡與眾多癌癥的發生、發展等有關。癌細胞自身創造的低氧、低pH值和低營養等不利的微環境都有助于引起ERS。但癌細胞能夠通過多種方式去適應這種環境應激，以阻止ERS誘導的細胞凋亡相關信號途徑[18]。當癌細胞無法適應環境的脅迫，持續的ERS將會誘導癌細胞凋亡的發生，如MESE等[21]研究發現GRP78表達上調能夠使人表皮細胞癌A431細胞株對CDDP的敏感性增強。王濤等[22]研究發現GRP94表達上調能夠增加肺癌細胞株NCI-H460對CDDP的敏感性。本研究顯示，用藥24 h后，TA、CDDP組與聯合組GRP78和GRP94表達均有所上調，且聯合組上調最高，表明ERS是TA和CDDP協同促進HepG2細胞凋亡的靶點之一。其機制可能是TA通過阻斷蛋白質從內質網到高爾基體之間的運輸，誘導HepG2細胞的ERS 水平升高，高水平的ERS通過激活PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6信號通路來抑制細胞DNA修復酶的活性，從而協同性增加CDDP對癌細胞的DNA 損傷作用[23-25]，最后激活Caspase 蛋白家族級聯反應[26]，誘導細胞凋亡的發生。然而，關于ERS 的PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6 信號通路激活的具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，TA和CDDP能夠協同增強肝癌HepG2細胞的凋亡，其協同作用與ERS途徑的激活有關，為TA與CDDP應用于臨床治療肝癌提供了理論基礎。

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