同型半胱氨酸經(jīng)PERK磷酸化激活CHOP-ERO1α通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的研究

杜海林，楊紹兵，叢廣志，王 凱，賈紹斌△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心，銀川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是體內(nèi)一種含硫氨基酸，近年相關(guān)研究表明，Hcy通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致疾病的發(fā)生，并將其列為心血管疾病重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。在Hcy致心血管疾病的眾多機(jī)制中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)作為近年來(lái)研究損傷與凋亡的熱點(diǎn)而備受關(guān)注[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和折疊的細(xì)胞器，體內(nèi)外諸多因素導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白集聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稱ERS。在未發(fā)生應(yīng)激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated-protein，GRP78)與胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(pancreatic-ER-kinase,PERK)、肌醇必須酶-1(inositol requiring RNAse-1，IRE1)及轉(zhuǎn)錄激活因子-6(activating-transcription factor-6，ATF-6)緊密結(jié)合在一起，抑制后三者激活[3]。在應(yīng)激狀態(tài)下，PERK、IRE1、ATF-6和GRP78解離，進(jìn)而結(jié)合未折疊蛋白，啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，阻止未折疊蛋白堆積而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。但長(zhǎng)時(shí)間ERS，PERK磷酸化為磷酸化PERK(p-PERK),后者激活下游的CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)及CHOP下游靶點(diǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1α(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1α，ERO1α)，啟動(dòng)凋亡程序[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭(CHF)患者血清Hcy水平較無(wú)心力衰竭患者增高，提示除缺血因素外，Hcy是導(dǎo)致CHF的又一獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其機(jī)制仍不清楚[5]。目前Hcy通過(guò)ERS促進(jìn)動(dòng)脈斑塊形成的報(bào)道較多，而Hcy對(duì)心肌的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討Hcy是否通過(guò)ERS導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其損傷是否和 CHOP-ERO1α通路激活所介導(dǎo)的凋亡有關(guān)，以為臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2心肌細(xì)胞由中喬新舟提供；Dulbecco′s 改良培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，4-苯基丁酸( 4-phenylbutyric acid，4-PBA)及Hcy購(gòu)自Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)制備試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；抗GAPDH單抗及抗β-actin單抗購(gòu)自中杉金橋公司；ER-Stress抗體試劑盒購(gòu)自Cell Signaling Technology；Anti-ERO1α抗體購(gòu)自Abcam公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗購(gòu)自中杉金橋公司；全蛋白提取試劑盒及BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自凱基生物公司；CCK-8細(xì)胞毒力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海合元生物公司；羅氏TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；酶標(biāo)儀由Thermo公司提供。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)Hcy及4-PBA對(duì)細(xì)胞損傷 將H9C2細(xì)胞于含10%FBS的DMEM(普通培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)：(1)將細(xì)胞重懸后接種于96孔板用于CCK-8檢測(cè)，密度為1×103個(gè)/孔，并將其分為對(duì)照組(H0)及H組，培養(yǎng)24 h使其貼壁，對(duì)照組給予普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，H組分別在上述普通培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、400、1 000 μmol/L的Hcy(分別為H50、H100、H400、H1000)，每組10個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后更換無(wú)血清DMEM，并向每孔中加入CCK-8檢測(cè)試劑10 μL。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組：僅加入無(wú)血清培養(yǎng)基及CCK-8檢測(cè)試劑。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。(2)取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞檢測(cè)4-PBA對(duì)細(xì)胞存活率的影響：將細(xì)胞分為對(duì)照組(P0)和P組，對(duì)照組給予普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，P組分別在上述普通養(yǎng)基中加入終濃度為1、2、3、4、5 mmol/L的4-PBA(分別為P1、P2、P3、P4、P5)，其余實(shí)驗(yàn)步驟同上,檢測(cè)出2 mmol/L的4-PBA對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷作用，并將此濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H9C2細(xì)胞，分為H組和HP2組，H組按上述(1)步驟加入不同濃度Hcy(分別為H50、H100、H400、H1000)。HP2組除按(1)步驟加入Hcy外，每組另加終濃度為2 mmol/L的4-PBA(分別為H50P2、H100P2、H400P2、H1000P2)，其余操作同前。經(jīng)過(guò)72 h干預(yù)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板OD值，通過(guò)OD值計(jì)算每孔細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A干預(yù)-A空白)/(A對(duì)照-A空白) ×100%。A干預(yù)指含有細(xì)胞、CCK-8溶液和干預(yù)試劑孔的OD值；A空白指含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞孔的OD值；A對(duì)照指含有細(xì)胞、CCK溶液而無(wú)藥物溶液孔的OD值。

1.2.2TUNEL凋亡染色 經(jīng)過(guò)CCK-8檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞半數(shù)抑制率及存活率選擇400 μmol/L的Hcy及2 mmol/L的4-PBA作為最適濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)先在24孔板中放入細(xì)胞爬片，向孔內(nèi)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，密度為1×104個(gè)/孔，并將其分為對(duì)照組、H400組、H400P2組，貼壁24 h后,對(duì)照組給予普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，H400組給予含Hcy終濃度為400 μmol/L上述普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，H400P2組在H400組基礎(chǔ)上加入終濃度為2 mmol/L的4-PBA。培養(yǎng)72 h后取出爬片，按羅氏TUNEL凋亡染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)視野下細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)，每組計(jì)數(shù)10個(gè)視野用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3免疫熒光檢測(cè)ERO1α表達(dá) 預(yù)先在24孔板中放入細(xì)胞爬片，向孔內(nèi)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，密度為 5×103個(gè)/孔，并將其分為對(duì)照組、H400組、H400P2組，貼壁24 h后,對(duì)照組給予普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，H400組給予含Hcy終濃度為400 μmol/L上述普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，H400P2組在H400組基礎(chǔ)上加入終濃度為2 mmol/L的4-PBA。培養(yǎng)72 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定，3%過(guò)氧化氫作內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理，1%Triton-X100通透，山羊血清封閉，加入抗ERO1α單抗(1∶200)于4 ℃過(guò)夜，次日PBS清洗后加入FITC標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(1∶100)，DAPI顯色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)紅染的陽(yáng)性細(xì)胞，并計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占該視野下細(xì)胞總數(shù)百分?jǐn)?shù)，每組計(jì)數(shù)10個(gè)視野用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)PERK/p-PERK/CHOP/ERO1α表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2細(xì)胞，重懸后將其接種于6孔板，密度為5×104個(gè)/孔，并將其分為對(duì)照組、P2組、H400組、H400P2組。貼壁24 h后，對(duì)照組給予普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；P2組給予含4-PBA終濃度為2 mmol/L的上述普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；H400組給予含Hcy終濃度為400 μmol/L的上述普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；H400P2組在H400組基礎(chǔ)上加入終濃度為2 mmol/L的4-PBA。培養(yǎng)72 h后使用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞全蛋白，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，以10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，室溫下脫脂牛奶封閉 90 min，加入相應(yīng)一抗：PERK(1∶1 000)、p-PERK(1∶1 000)、 CHOP(1∶1 000)、ERO1α(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)于4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ClinxChemiScope6300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光，并使用系統(tǒng)配套軟件分析條帶灰度值。以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，將3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果所測(cè)得的灰度值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1Hcy及4-PBA對(duì)細(xì)胞損傷 經(jīng)不同濃度Hcy干預(yù)72 h后，細(xì)胞存活率明顯降低，且隨Hcy濃度增加存活率呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 039.580,P<0.01)，見(jiàn)圖1A。當(dāng)Hcy濃度為400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率接近半數(shù)抑制率，故選用Hcy濃度為400 μmol/L完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4-PBA為3 mmol/L時(shí)，可見(jiàn)明顯損傷作用。而4-PBA為2 mmol/L時(shí)，對(duì)H9C2心肌細(xì)胞無(wú)明顯損傷作用，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.245,P=0.823)，見(jiàn)圖1B，故選用2 mmol/L的4-PBA作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。Hcy濃度為50 μmol/L時(shí)，是否加入4-PBA，細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.320,P=0.755)，見(jiàn)圖1C。隨著Hcy濃度增大，HP2組細(xì)胞存活率較同濃度H組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.161、29.255、52.474，P<0.01)。

A:Hcy干預(yù)后細(xì)胞存活率；B:4-PBA干預(yù)后細(xì)胞存活率；C:相同Hcy濃度下H組與HP2組細(xì)胞存活率比較；a：P<0.01，與H組比較

圖1不同濃度Hcy及4-PBA干預(yù)后的細(xì)胞存活率

A:上圖為視野下所有細(xì)胞，下圖為凋亡細(xì)胞(×400)；B：不同組凋亡平均百分?jǐn)?shù)比較;a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與H400組比較

圖2 TUNEL細(xì)胞凋亡染色檢測(cè)

A:上圖為視野下細(xì)胞總數(shù)，下圖為陽(yáng)性細(xì)胞(×400)；B：各組ERO1α表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)；a：P<0.01，與對(duì)照組比較;b:P<0.01，與H400組比較

圖3免疫熒光染色檢測(cè)ERO1α表達(dá)

a:P<0.01,與示H400組比較；bP<0.01，與H400P2組比較

圖4各組PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)在各組中的條帶灰度值

2.2TUNEL凋亡染色 H400組經(jīng)400 μmol/L的Hcy干預(yù)后，與對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞分?jǐn)?shù)明顯增加(t=21.593,P<0.01)；H400P2組由于培養(yǎng)基中含有2 mmol/L的4-PBA,與H400組比較，細(xì)胞凋亡分?jǐn)?shù)明顯減少(t=8.742,P<0.01)，見(jiàn)圖2A、B。

2.3免疫熒光檢測(cè)ERO1α表達(dá) 與對(duì)照組比較，H400組細(xì)胞質(zhì)ERO1α表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.205,P<0.01)；而同時(shí)經(jīng)Hcy及4-PBA干預(yù)的H400P2組，ERO1α表達(dá)與H400組比較明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.908,P<0.01)，見(jiàn)圖3A、B。

2.4Western blot檢測(cè)PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表達(dá) H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)400 μmol/L的Hcy干預(yù)后，ERS相關(guān)蛋白PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)均有所增加，與對(duì)照組比較，各因子表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=70.326、15.973、69.353、39.019,P<0.01)。與H400組比較，H400P2組PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)均有所下降(t=40.766、9.540、30.390、12.587,P<0.01)，見(jiàn)圖4。

3 討 論

Hcy作為體內(nèi)蛋氨酸脫甲基代謝的一種中間產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性。當(dāng)前的一些研究證實(shí)其毒性作用可致全身多種疾病，包括2型糖尿病、腫瘤、腎臟疾病及動(dòng)脈粥樣硬化等[6-7]。本研究第一次觀察到Hcy對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷作用，并通過(guò)細(xì)胞模型探討了損傷的機(jī)制，對(duì)臨床高同型半胱氨酸血癥(HHcy)的干預(yù)提供了理論依據(jù)。

HHcy(≥10 μml/L)是WHO近年公布的致心血管疾病新的危險(xiǎn)因素[8]。關(guān)于Hcy致心血管疾病的機(jī)制，較為明確的有：(1)Hcy誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]；(2)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖等導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[10]；(3)誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制因子和DNA損傷誘導(dǎo)因子(GADD34)及T細(xì)胞死亡基因51(TDAG51)表達(dá),觸發(fā)ERS反應(yīng)[11]。本課題組首先通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)到了Hcy對(duì)心肌細(xì)胞損傷，同時(shí)通過(guò)TUNEL染色，證實(shí)了Hcy致心肌損傷的機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡所致，最后采用免疫熒光及Western blot等手段，觀察到了經(jīng)Hcy干預(yù)后，ERS通路中，凋亡調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)增加，清楚地闡明了Hcy通過(guò)ERS致心肌凋亡的一條通路。首次發(fā)現(xiàn)了Hcy通過(guò)ERS機(jī)制，直接導(dǎo)致心肌損傷。

Hcy是人體蛋氨酸代謝的產(chǎn)物，體內(nèi)葉酸和維生素B12缺乏都將導(dǎo)致血清Hcy積聚[12]。故目前對(duì)HHcy的預(yù)防主要是補(bǔ)充維生素B12和葉酸[13]。但近來(lái)一些臨床相關(guān)的Meta分析顯示，人為的補(bǔ)充VB12和葉酸并不能降低臨床發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[14]。因此需要探索新的手段對(duì)臨床高Hcy進(jìn)行干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在含有Hcy的培養(yǎng)基中加入4-PBA，細(xì)胞損傷明顯減輕，TUNEL染色也提示相應(yīng)凋亡細(xì)胞比例減少，Western blot也顯示，4-PBA干預(yù)后的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路相關(guān)蛋白PERK、p-PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)均有所下降，而CHOP及ERO1α被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的起始因子，此二者表達(dá)增加提示Hcy可以經(jīng)凋亡通路介導(dǎo)心肌損傷[15-16]。其機(jī)制可能為4-PBA作為一個(gè)分子伴侶，通過(guò)阻斷炎癥信號(hào)，穩(wěn)定蛋白構(gòu)象而抑制ERS[17]。同時(shí)通過(guò)輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行正確的蛋白折疊，減輕ERS負(fù)擔(dān)，從而抑制 CHOP及其下游分子ERO1-α轉(zhuǎn)錄和翻譯，減輕心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新之處在于引入4-PBA，一方面利用其對(duì)ERS的阻斷作用，證實(shí)ERS在Hcy致心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要性，另一方面也為血清高Hcy的干預(yù)尋找可能的靶點(diǎn)。

總之，本研究證實(shí)了Hcy對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷，其對(duì)心肌細(xì)胞的損傷是通過(guò)促細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，至少有一條通路是通過(guò)激活ERS，促進(jìn)PERK磷酸化，介導(dǎo)CHOP及ERO1α表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究還有許多不足之處，比如，未探討Hcy對(duì)ERS其他通路的影響，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等，這些不足課題組將在后續(xù)研究中加以補(bǔ)充。

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