東北地區動物源糞腸球菌耐藥性監測與分析

李延山，李欣南，韓鐫竹，高 鐸，武鳳嬌

（1.遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003；2.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽110016）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球菌，是人和動物腸道內主要菌群之一[1]，占腸道菌群的82%～87%[2]，具有重要的生理功能。其能產生細菌素等抑菌物質，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環境[3]；還能抑制腸道內產尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內毒素的含量，使血液中氨和內毒素的含量下降[4]。農業部在2008年公布的第1126號公告《飼料添加劑品種目錄》中將其列為允許在飼料中添加的益生菌種類[5]。但在發揮作用的同時，糞

1.1 菌株來源糞腸球菌質控菌株為ATCC29212，購自中國獸藥監察所；豬肛門或雞泄殖腔棉拭子來源于肉雞和生豬養殖場（戶）。腸球菌也是一種條件致病菌[6]。在動物中，常見糞腸球菌引發狗的外耳炎[7]，家禽的敗血癥和心內膜炎[8-9]及仔豬的關節炎和敗血癥[10]等。本文借鑒選擇分離、生化鑒定、藥物敏感性試驗等方法[11-12]，通過分析東北地區健康動物中糞腸球菌的耐藥性變化趨勢，為臨床糞腸球菌的應用提供參考。

1 材料與方法

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）、全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）、恒溫培養箱（德國BINDER公司）、ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養基與材料運送培養基、腸球菌肉湯培養基、哥倫比亞血瓊脂購自北京陸橋技術有限責任公司；糞腸球菌瓊脂培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；API NaCl 0.85%培養基、rapid ID 32 STREP鑒定條均購自BIOMERIEUX公司；腸球菌藥敏檢測板購自天津市金章科技發展有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣用滅菌棉簽采集動物肛門和泄殖腔樣品，置入運送培養基中0～4℃保存。

1.4.2 分離純化將拭子樣品直接接入腸球菌肉湯中，36±1℃培養48 h。挑取預增菌培養物劃線接種于糞腸球菌瓊脂培養基36±1℃培養48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36±1℃培養24 h，備用。

1.4.3 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線純化培養不超過24 h。將待檢細菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養基，制備4.0麥氏濃度的菌懸液，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應杯中，每個反應杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養4小時，用細菌鑒定儀判讀。

1.4.4 藥物敏感性試驗用接種環挑取營養瓊脂平板上培養1～18小時的3～5個單菌落，用無菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏單位。取M-H肉湯稀釋至5×105CFU/mL濃度的菌液0.1 mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。將加有菌液和抗菌藥物的板，置37℃培養箱中培養20～24 h。取出培養后的板，觀察結果，以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。在質控菌株的最低抑菌濃度符合規定范圍的前提下，按判斷標準判斷被檢菌株的敏感性—敏感（S），中度敏感（I）或耐藥（R），判定標準參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準。

2.1 分離純化結果采集了東北地區26個養殖場的豬肛門或雞泄殖腔棉拭子共780份樣品，分離鑒

2 結果與分析

定得到289株糞腸球菌，分離率為37.05%。在腸球菌肉湯中，培養后混濁變黑為疑似菌株，仍保持澄清透明、棕褐色為陰性，具體結果見圖1。

圖1 腸球菌肉湯中的生長情況Fig.1 The growth condition of Enterococcus broth

糞腸球菌瓊脂培養基上帶棕色環的棕黑色菌落，邊緣光滑沒有白色潤圈的為疑似單菌落，白色菌落為其他菌株，結果見圖2。最終在哥倫比亞血瓊脂上菌落圓形、純白色，表面凸起濕潤，有光澤，邊緣整齊的菌落確定為陽性糞腸球菌，結果見圖3。

圖2 陽性糞腸球菌在糞腸球菌瓊脂培養基上的生長形態Fig.2 The growth pattern of positive Enterococcus faecalis in the agar medium of Enterococcus faecalis

圖3 糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂上的生長狀態Fig.3 The growth state of Enterococcus faecalis on Columbia blood agar

2.2 鑒定結果經細菌鑒定儀判讀后得到的糞腸球菌生化鑒定，與中國微生物菌種目錄給出的糞腸球菌一致。

2.3 藥物敏感性試驗結果

2.3.1 糞腸球菌的耐藥率和MIC分布根據藥敏試驗結果，將最小抑菌濃度minimum inhibitory concentration，MIC）分布列于表1。

總體來說，糞腸球菌對13類測試抗生素普遍耐藥，豬源糞腸球菌和雞源糞腸球菌的耐藥狀況沒有明顯區別，均對截短側耳素類、頭孢菌素類、大環內酯類和林可胺類高度耐藥，對萬古霉素高度敏感。

豬源糞腸球菌對青霉素類、頭孢菌素類、磺胺異噁唑、截短側耳素類、大環內酯類和林可胺類藥物耐藥率均大于90.0%；對氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類和氯霉素類耐藥率介于30.0%～80.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區域；對β-內酰胺類復合物、唑烷酮類和萬古霉素相對敏感，耐藥率小于10.0%，多數菌株MIC仍然分布在敏感區域。

雞源糞腸球菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類、磺胺異噁唑、截短側耳素類、大環內酯類和林可胺類藥物耐藥率均大于88.0%；對四環素類、喹諾酮類、氯霉素類、復方新諾明耐藥率介于30.0%～70.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區域；對β-內酰胺類和萬古霉素相對敏感，耐藥率小于10.0%，多數菌株MIC仍然分布在敏感區域。

表1 東北地區豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況Table 1 The resistance rate of Enterococcus faecalis and MIC distribution of Pig and chicken source in Northeast China

表1 東北地區豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況（續）

2.3.2 糞腸球菌的EUCAST分布 將得到的MIC分布結果與歐盟藥敏試驗標準（European Committee Antimicrobial Susceptibility Testing， EUCAST）進行比較，結果如圖4所示。由圖4可以看出，代表藥物MIC分布整體相對集中，變化不大，相對于EUCAST的MIC整體水平右移，MIC在增大，導致耐藥率增高。

2.3.3 多重耐藥性狀況 本文中的多重耐藥均是以藥物類別來進行統計分析。總體來看，不同動物來源的菌株多重耐藥率沒有明顯差異，4類及4類以上糞腸球菌耐藥菌株占98.61%；10類糞腸球菌耐藥株占1.73%，未見全部耐藥菌株（見圖5）。

圖4 東北地區豬、雞源腸球菌代表藥物的MIC分布圖Fig.4 The MIC distribution of Enterococcus drug representatives of Pig and chicken in Northeast China

圖5 東北地區豬、雞源腸球菌多重耐藥折線圖Fig.5 Multiple resistance line diagram of Enterococcus source of Pig and chicken in Northeast China

3 討論

本文對東北地區的動物源糞腸球菌進行了耐藥性監測，藥敏試驗表明分離獲得的糞腸球菌對臨床常用的多種抗菌藥物有較高的耐藥率，耐藥率較高的幾種常見抗生素依次為頭孢菌素類、磺胺異噁唑、截短側耳素類、大環內酯類和林可胺類藥。這幾類抗菌藥物中，一些耐藥性是天然耐藥，例如頭孢菌素類；一些是獲得性耐藥，例如磺胺類，說明該類抗菌素用藥壓力嚴重，若繼續使用不但增加治療預防成本，也會誘發耐藥性的進一步遷移，因此，臨床用藥應參考耐藥性監測結果進行合理調整，降低耐藥性的產生。

在我國，耐萬古霉素腸球菌感染的發生率呈逐年上升趨勢，耐萬古霉素腸球菌是臨床重要病原菌之一，通過監測發現，在東北地區尚未發現耐萬古霉素的糞腸球菌，應持續監測及時預警。

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