H1N1亞型三個譜系豬流感病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立

蘭德松

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164）

豬流感（Swine influenza，SI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）感染豬引起的一種高度接觸性呼吸道傳染病，發病率高、傳播迅速、但死亡率較低[1]。SI作為豬其他疾病的一種重要的誘因之一，在規模化養豬場中普遍存在，難以根除。除SIV單獨感染造成的直接損失外，由于SIV感染導致呼吸道上皮細胞損傷，感染豬易繼發感染或混合感染其他細菌或病毒病，使疫情變得更為復雜，死亡率升高[2-3]。目前，SI已在世界大部分國家廣泛存在并造成嚴重經濟損失，是目前危害養豬業的重大疾病之一。更重要的是，由于豬呼吸道上皮細胞中有SA-α-2、6-Gal和SA-α-2，3-Gal兩種受體，導致豬對SIV、禽流感病毒和人流感病毒均易感，多種類型的流感毒株可在豬體內發生基因重配產生新的毒株，因此豬被認為是流感病毒重組的“混合器”及產生新亞型毒株的活載體[4-6]，鑒于SI在禽流感和人流感的流行、傳播和流感病毒分子變異中的特殊作用，因而其公共衛生學意義重大。目前，在世界范圍內引起SI的主要有H1N1、H1N2和H3N2三種亞型SIV[7-8]。其中，H1N1亞型SIV為豬群中SIV感染的優勢亞型毒株，H1N1亞型SIV又分為古典型、類人型、類禽型和2009年在人群中大流行的甲型H1N1 4個譜系[8-9]，其中，又以古典型、類禽型和甲型H1N1三個譜系感染較為普遍，危害較大。目前SI在我國養豬業中已經廣泛存在，SI的診斷與防制已成為我國養豬業面臨的重大問題，SI的有效防控對控制豬群感染其他細菌或病毒同樣具有重要意義、同時能促進人流感和禽流感的有效防控。本研究建立H1N1亞型古典型、類禽型和甲型三個譜系的SIV的鑒別診斷方法，實現對H1N1亞型SIV不同譜系的快速、準確的鑒別診斷，進而為政府部門和養殖場戶有針對性地采取綜合防控措施提供有力技術支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株、血清及核酸古典型、類禽型和甲型H1N1三個譜系H1N1亞型SIV由本實驗室分離并保存，不同亞型SIV標準抗原和血清由哈爾濱獸醫研究所動物流感參考實驗室提供；H5、H7和H9亞型流感病毒核酸為匹基生物試劑盒中提供的標準陽性對照。

1.2 主要試劑及儀器核酸提取試劑（適用于提取病毒DNA/RNA）為天隆科技有限公司產品；TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）（40 U/μL、dNTP（2.5 mmol/L）、M-MLV反轉錄酶（5 U/μL）、DTT（0.1 mmol/L）、Premix EX Taq等為寶生物（大連）有限公司（TaKaRa）產品；低溫高速離心機為美國Thermo公司產品；C1000 PCR擴增儀、BIORAD-3000電泳儀和Gel Doc XR+凝膠成像系統為美國BIO-RAD公司產品。

1.3 臨床樣品的采集與前處理豬鼻咽拭子和肺臟等臨床樣品，采自遼寧省不同地區豬場和豬屠宰場（采集鼻咽拭子樣本）。

豬鼻咽拭子的采集與前處理：用病毒采集管采取臨床疑似豬流感活體豬的鼻腔和咽喉拭子，編號備用，待檢；豬肺臟樣本的采集與前處理：采取病死豬的肺臟，稱取1 g肺臟組織進行研磨，然后加入1 mL滅菌PBS，混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液轉入1.5 mL離心管中編號備用，待檢。

1.4 引物設計及合成根據甲型、古典型及類禽型H1N1亞型不同譜系SIV的血凝素（Haemagglutinin，HA）基因保守區序列設計3套引物（表1），參考序列GenBank收錄號分別為：GQ259909、FJ789832和JQ319648，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 病毒RNA提取及RT-PCR方法的建立按照核酸提取試劑說明書進行病毒RNA的提取，并用Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′引物進行反轉錄，體系（25 μL）如下：DEPC處理的水 11.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，Uni1（220 μmol/L）1 μL，DTT（0.1 mmol/L）2.5 μL，5×Reverse Transcriptase XL Buffer 5 μL，M-MLV反轉錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，總RNA 2 μL。反轉錄條件：反應體系混勻后，37℃，水浴1 h；70℃，水浴15 min；反轉錄獲得的cDNA直接用于PCR或-20℃保存備用。通過正交試驗對PCR的引物終濃度、模板濃度等反應要素條件進行優化，通過梯度試驗對引物退火溫度進行優化。

1.6 RT-PCR方法的特異性試驗應用本試驗建立的RT-PCR方法分別對甲型、古典型及類禽型H1N1亞型不同譜系SIV核酸及H5、H7和H9亞型流感病毒、CSFV及PRRSV核酸進行RT-PCR檢測，驗證方法的可靠性及其特異性。

1.7 RT-PCR方法的敏感性試驗分別對甲型、古典型及類禽型H1N1亞型三種譜系SIV的核酸進行10倍倍比稀釋，再進行RT-PCR反應，各取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠孔中進行電泳鑒定。

1.8 RT-PCR方法的重復性試驗實驗室不同人員平行提取甲型、古典型及類禽型H1N1亞型SIV的總RNA，重復進行3次RT-PCR反應，驗證方法的重復性。

1.9 RT-PCR方法對臨床樣品的檢測將采集的460份豬鼻咽拭子樣品接種雞胚，收取尿囊液，進行血凝和血凝抑制試驗（HA-HI），鑒定亞型；應用本試驗建立的RT-PCR方法進行檢測，比較方法之間的符合率。

2 結果

2.1 PCR條件優化的結果確定PCR反應體系（25 μL）為：Premix EX Taq，12.5 μL；滅菌蒸餾水10.5 μL；上、下游特異性PCR引物（10 μmol/L），各0.5 μL；反轉錄產物cDNA，1 μL。最終確定擴增反應條件為：94℃，3 min；94℃，30 s，54℃，30 s，72℃，1 min，35個循環；72℃7 min。

圖1 H1N1三個譜系SIV RT-PCR特異性試驗結果Fig.1 The specificity test results of RT-PCR of three sublineage of H1N1 Subtype SIV

圖2 H1N1三個譜系RT-PCR靈敏度試驗結果Fig.2 The sensitivity test results of RT-PCR of three sublineages of H1N1 Subtype SIV

2.2 特異性試驗試驗表明，甲型H1N1、古典型H1N1和類禽型H1N1 RT-PCR方法均能特異性地檢測出相應的SIV核酸，分別在476、293和997 bp位置出現特異性條帶，而與其他病毒均無交叉反應（見圖1）；用本試驗建立的RT-PCR方法對雞胚分離的陽性樣品的檢測結果與尿囊液的病毒亞型鑒定結果一致；同時分別回收純化3個不同譜系的目的片段，送上海生工生物公司進行序列測定，然后應用DNA-star軟件分析其同源性，結果測定序列與參考序列同源性達99%以上，表明該方法具有良好的特異性。

2.3 RT-PCR方法的敏感性試驗結果試驗結果表明，甲型和古典型H1N1亞型SIV RT-PCR可檢測出稀釋至10-5的模板cDNA（見圖2A、B），類禽型H1N1 RT-PCR方法可檢測出稀釋至10-6的模板cDNA（見圖2C）；利用分光光度計測定核酸濃度，按照《分子克隆實驗指南》（第三版）中的方法換算成拷貝數，結果：甲型H1N1、古典型H1N1和類禽型H1N1 RT-PCR方法可檢測的極限拷貝量分別為1 896、1 655和1 459拷貝/μL SIV核酸。

2.4 RT-PCR方法的重復性試驗結果3次平行提取甲型、古典型及類禽型H1N1亞型SIV陽性樣品的總RNA進行了RT-PCR重復性檢測，試驗結果表明該方法具有良好的重復性（見圖3）。

2.5 RT-PCR方法對臨床樣品的檢測460份鼻咽拭子經雞胚接種后用HA-HI方法鑒定，結果：甲型H1N1 SIV陽性3份、類禽型H1N1 SIV陽性6份、古典型H1N1 SIV未檢測到,陽性率分別為0.65%、1.30%、0%；本試驗建立的H1N1亞型3譜系RT-PCR方法對尿囊液進行檢測，結果與HA-HI檢測結果一致，符合率為100%。

圖3 H1N1三個譜系SIV RT-PCR重復性試驗結果Fig.3 The sensitivity test results of RT-PCR of three sublineages of H1N1 Subtype SIV

3 討論

在1918年人流感暴發期間，北美豬群中首例SI被報道，Shope等人于1930年首次分離并鑒定了SIV，命名為“古典型H1N1”（Classical Swine H1N1,CS H1N1）SIV，該型SIV在北美和亞洲國家一直流行，直到1976年通過從美國引種而傳到意大利，隨后傳遍整個歐洲，直到1979年，歐洲豬群僅發現單一感染CS H1N1 SIV。隨后，在1979年，相繼在歐洲的比利時和德國分離到抗原性與遺傳性與CS H1N1有顯著差異的SIV，被命名為“歐亞類禽型豬 H1N1”（Eurasianavian-likeswineH1N1,EA H1N1），該型SIV迅速傳遍整個歐洲，并取代CS H1N1 SIV成為豬群中的優勢毒株[4,10-11]。管毅等[12]于1996年首次報道在我國的南方部分省份豬群中分離到類禽型H1N1亞型SIV，經遺傳進化分析表明，分離株位于EA H1N1大分支內，但形成一個獨立的亞洲分支譜系。近年來的監測表明，類禽型H1N1 SIV已成為我國豬群中的優勢毒株。另外，據Qi等[13]、Wang等[14]報道，相繼于2011年在中國江蘇、2012年在中國河北各一名患嚴重肺炎死亡的3歲男童體內分離到H1N1亞型流感病毒株，通過遺傳分析表明，分離株與中國豬群中流行的類禽型H1N1亞型和歐洲流行的EA H1N1亞型SIV在抗原性和遺傳性方面密切相關，可能為SIV直接感染人而在人體內適應的結果，表明了類禽型H1N1亞型流感病毒具備跨種間傳播的能力[15]。2009年爆發的甲型H1N1流感疫情，起初被報道為“SI”疫情，經過遺傳分析表明，該型病毒為三源重配病毒，該病毒的前體已在豬群中流行長達17年之久[16]。

RT-PCR方法是當前鑒定病毒的可靠方法，在病毒亞型鑒定、測序分析等方面具有重要作用，很多實驗室建立的快速診斷方法能區分不同亞型的SIV，如齊海濤等[17]建立的SIV分型RT-PCR方法，能對H1、H3、N1、N2亞型進行鑒別診斷；王博等[18]建立的SIV雙重熒光定量RT-PCR方法，能對H1、H3亞型進行鑒別診斷，但均不能特異性的實現對H1N1亞型古典型H1N1、類禽型H1N1和甲型H1N1等3個譜系的快速鑒別檢測，而近年來的監測結果表明，類禽型H1N1和甲型H1N1為當前我國豬群中流行的優勢毒株，古典型H1N1也偶爾能監測到[19]，因此，本試驗建立的鑒別診斷方法對這3個譜系的鑒別診斷具有重要意義。但由于普通RT-PCR方法自身在靈敏度上的缺陷，該方法較熒光RT-PCR方法靈敏度低幾十倍，在低病毒載量樣本的檢測中可能出現假陰性結果，但該方法特異性和重復性良好，結合雞胚接種分離病毒的方法將在H1N1亞型SIV的檢測及3個譜系鑒別診斷中發揮重要作用。

4 結論

本試驗建立H1N1亞型古典型H1N1、類禽型H1N1和甲型H1N1 3個主要譜系SIV的鑒別診斷RT-PCR方法，該方法敏感性高、特異性強、重復性好，可作為對H1N1亞型3個主要譜系SIV快速鑒別診斷的有效檢測手段，應用前景良好。

[1]阮寶陽，宮曉倩，劉曉敏，等.重組歐洲禽源H1N1亞型豬流感病毒疫苗株的構建及免疫保護效力[J].中國獸醫學報，2016，36（12）：2106-2112，2118.

[2]Ma W, Kahn R E, Richt J A. The pigs as a mixingvessel for influenza viruses:Human andveterinary implications[J]. Journal of MolecularGenetic Medicine, 2008, 3(1): 158-166.

[3]楊帥，朱聞斐，舒躍龍，等.豬流感病毒概述[J].病毒學報，2013，29（3）：330-336.

[4]Brown I H.The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J].Veterinary Microbiology,2000,74(1/2):29-46.

[5]Elisa C,Tufaria M,Lorenzo F,et al.Review:Influenza virus in pigs[J].Molecular Immunology,2013,55:200-211.

[6]徐匯洋，許榜豐，陳艷，等.一株H1N1豬流感病毒的進化分析與分子特征[J].中國農業科學，2015，48（15）：3071-3078.

[7]祁賢，陸承平.豬流感病毒進化方式及其流行特點[J].微生物學報，2009，49（9）：1138-1145.

[8]孟沙沙，喬傳玲，陳艷，等.一株類禽型H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳系統的建立[J].中國預防獸醫學報，2013，35（2）：91-94.

[9]Sikkema R S,Frelel G S,de Bruin E,et al.Weighing serological evidence of human exposure to animal influenza viruses-a literature review[J].Eurosurveillance,2016,21(44):30388.

[10]Liu J H,Bi Y H,Qin K,et al.Emergence of European avian influenzavirus-LikeH1N1 swine influenza A viruses in China[J].Journal of Clinical Microbiology,2009,47(8):2643-2646.

[11]Simon J W,Pinky L,Scott M R,et al.Molecular Epidemiology and Evolution of Influenza Viruses Circulating within European Swine between 2009 and 2013[J].Journal of Virology,2015,89(19):9920-9931.

[12]Guan Y,Shortridge K F,Kruss S.Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China[J].Journal of Virology,1996,70(11):p8041-8046.

[13]Qi X, Cui L B, Jiao Y J, et al. Antigenicand genetic characterization of a Europeanavian-like H1N1 swine influenza virus from aboy in China in 2011[J]. Archives of Virology,2013, 158: 39-53.

[14]Wang D Y, Qi S X, Li X Y, et al. Human Infectionwith Eurasian Avian-like Influenza A(H1N1) Virus, China[J]. Emerging InfectiousDisease, 2013, 19(10): 1709-1711.

[15]蘭德松，趙鳳菊，魏澍，等.遼寧省H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定與遺傳演化分析[J].現代畜牧獸醫，2013，12：24-28.

[16]Webster R G and Govorkova E A.Continuing challenges in influenza[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2014,1323(1):115-139.

[17]齊海濤，孔維立，張桂紅，等.豬流感病毒H1、H3、N1、N2亞型分型RT-PCR方法的建立[J].中國畜牧獸醫，2012，39（3）：187-191.

[18]王博，王慧煜，趙寶華，等.H1、H3亞型豬流感病毒雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用[J].中國畜牧獸醫，2012，39（3）：187-191.

[19]隋金鈺，楊大為，楊煥良，等.我國部分省份豬群中流感病毒血清學抗體的調查[J].中國預防獸醫學報，2016，38（1）：11-14.