高效液相色譜法測(cè)定消癌平注射液中通關(guān)藤苷G含量

王祁民，馬銀玲，李 穎，安 靜

（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051）

消癌平注射液為通關(guān)藤（烏骨藤）的根、藤莖提取物制成的水溶液，具有止咳平喘、清熱解毒、化痰軟堅(jiān)等功效，主要用于治療肺癌、胃癌、肝癌、食道癌等各種惡性腫瘤[1－3]，療效較好，但仍見(jiàn)不良反應(yīng)報(bào)道[4]，因此需要對(duì)其成分進(jìn)行分析。消癌平注射液含多種成分，包括酚酸類、C21甾體苷類、甾醇／環(huán)醇類、多糖類、三萜類化合物等，近年的研究顯示，其主要活性成分為甾體苷類化合物[5]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其中通關(guān)藤苷G的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測(cè)器（美國(guó) Waters公司）；PHs－3c型電子 pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；AB204－S型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）；KQ3200型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雷勃爾LG16－B型高速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）。

試藥：通關(guān)藤苷G對(duì)照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)為160103，純度＞98%）；消癌平注射液（南京圣和制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025868，批號(hào)分別為201603111，201603021，201604191，規(guī)格為每支 20 mL）；甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Merk公司），水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0．1%磷酸水溶液(45∶55)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1 mL ／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2．2 溶液制備

取消癌平注射液，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過(guò)，離心（12 000 r／min）10 min，取上清液作為供試品溶液。取通關(guān)藤苷G對(duì)照品13．4 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度為1．34 g／L 的對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性考察：取對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度為67 μg／mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液（甲醇）各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為 4，6，8，10，20，40，60，80 μg ／mL 的系列溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、待測(cè)物質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝5×106X－6 011．7（r＝0．999 4）。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷 G質(zhì)量濃度在 4～80 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液適量，制備成通關(guān)藤苷G低、中、高質(zhì)量濃度（20．1，33．5，40．2 μg ／mL）的對(duì)照品溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液的 RSD分別為1．36%，1．79%和2．11%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為2．05%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201603021）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1．42%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

耐用性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201603021）樣品，改變流動(dòng)相中磷酸含量（分別為 0．05%，0．1%，0．15%）后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果的 RSD 為 1．83% （n＝6）；改變柱溫（分別為20℃，25℃，30℃）后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果的RSD為 1．32%（n＝6）；按擬訂色譜條件，分別用色譜柱 Symmetry C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Kromisil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm），Phenome－nex Gemini C18柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果的 RSD為1．78%（n＝6）。結(jié)果表明該方法試驗(yàn)?zāi)陀眯粤己谩?/p>

加樣回收試驗(yàn)：取供試品溶液適量，共9份，分別加入同體積低、中、高質(zhì)量濃度（6．7，10．1，13．4 μg ／mL）對(duì)照品溶液，分別精密吸取混合溶液20 μL，注入色譜儀，測(cè)定，以峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果3批（批號(hào)分別為201603111，201603021，201604191）樣品通關(guān)藤苷 G 含量分別為 9．98，10．02，10．07 μg ／mL。

表1 通關(guān)藤苷G加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

3 討論

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，通關(guān)藤苷G的最大吸收波長(zhǎng)為230 nm，因此確定230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相篩選發(fā)現(xiàn)，以乙腈－水（45∶55）等度洗脫時(shí)，對(duì)照品溶液中通關(guān)藤苷G出峰較好，但供試品溶液中的通關(guān)藤苷G與相鄰色譜峰分離度較差；以乙腈－0．1%磷酸水溶液（45∶55）為流動(dòng)相時(shí)，通關(guān)藤苷G色譜峰與相鄰峰分離好（分離度大于1．5），故最終選定等度洗脫。

消癌平注射液含有甾體皂苷、酚酸、萜類、多糖等多種成分[6]，C21甾體皂苷是其主要活性成分[7]。目前，從通關(guān)藤藥材中提取分離出的C21甾體皂苷達(dá)50多種[8]，C21甾體皂苷是一類苷元為孕甾烷衍生物與2－去氧糖等形成的苷，廣泛分布于龍膽科、薯蕷科、毛茛科、夾竹桃科、蘿 科等植物。通關(guān)藤苷G在通關(guān)藤藥材中有一定含量，但在消癌平注射液中的含量需要建立可行的方法測(cè)定才能明確，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇通關(guān)藤苷G作為消癌平注射液含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

[1]李邇娜，王 芳，欽 松，等．消癌平注射液抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(9)：111 －112．

[2]謝麗艷．消癌平注射液藥物相互作用研究[D]．南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2013．

[3]曾慶花．消癌平注射液的藥代動(dòng)力學(xué)及相互作用研究[D]．上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2013．

[4]朱 紅，劉峰群．醫(yī)院13例消癌平注射液不良反應(yīng)報(bào)告分析[J]．中國(guó)藥業(yè)，2015，24(17)：69 － 70．

[5]錢(qián) 軍，華海濤，秦叔逵．通關(guān)藤制劑抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中藥雜志，2009，34(1)：11 － 13．

[6]韓 麗，張 慧，康廷國(guó)，等．中藥通關(guān)藤的研究進(jìn)展[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34(10)：2329 －2331．

[7]謝麗艷，居文政，周 玲，等．通關(guān)藤及其制劑的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]．現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(6)：439 －443．

[8]方奕奇，孫雪梅．通關(guān)藤化學(xué)成分及抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(2)：165 －167．