正交試驗設計優化藍刺頭總黃酮提取工藝

鄭 敏

（內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010010）

藍刺頭 Echinops latifalius Tausch．為菊科藍刺頭屬植物，以根入藥，名為“禹州漏蘆”，均收載于歷版《中國藥典(一部)》，主要用于清熱解毒、排膿止血、消癰下乳[1]。藍刺頭的干燥頭狀花序為蒙古族常用藥材，名為“藍刺頭”，蒙藥名為“扎日阿－烏拉”，是一種具民族特色及地方特色的植物藥，在民族醫藥及民間廣泛應用。其味苦，性稀、柔、輕、鈍、涼，具有固骨質、接骨愈傷、清熱止痛的功效，用于骨折、骨熱、刺痛等證[2]。曾有報道禹州漏蘆的研究情況[3－6]，而蒙藥藍刺頭的研究文獻極少。藍刺頭屬植物含有噻吩類、黃酮類、三萜類、生物堿類、脂肪酸和甾醇類等多種化合物[7－8]，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲、保肝等多種藥理活性[9－11]。黃酮類化合物因其廣泛的生物活性已成為研究熱點，但對其提取工藝研究較少。本研究中對藍刺頭總黃酮的提取工藝進行了初步探討，為其開發利用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AL204型電子天平（十萬分之一，梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司）；RE－52A型旋轉蒸發儀（上海振捷實驗設備有限公司）。

1．2 試藥

藍刺頭 Echinops latifalius Tausch．購自安國義通中藥材有限公司，經我院中藥鑒定室高級工程師劉斌主任鑒定，均符合相關規定[2]；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080－201409，純度為98%）；甲醇為色譜純（德國Merck公司，批號為20140213）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 藍刺頭提取物制備

分別取藍刺頭藥材粉末9份，每份40 g，按正交試驗表的因素和水平進行加熱回流提取，提取液過濾，濾液定容至1 000 mL容量瓶，備用。精密吸取 10 mL，置25 mL容量瓶，加95%乙醇10 mL，加水稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，即得。

2．2 總黃酮含量測定

2．2．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm)；流動相：甲醇 －0．4% 磷酸(45 ∶55)；流速：1．0 mL ／min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2．2．2 溶液制備

取蘆丁對照品6．21 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，加甲醇使溶解至刻度，即得質量濃度為0．621 g／L的標準溶液，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液1 mL，置10 mL容量瓶，加甲醇使溶解至刻度，搖勻，即得每1 mL含62．10 μg的對照品溶液。

將藍刺頭藥材粉碎，過80目篩。稱取藍刺頭藥材粉末約 0．5 g，精密稱定，置錐形瓶，精密加入 95%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理15 min，取出，放冷，用80%甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2．2．3 方法學考察

標準曲線制備：分別精密吸取蘆丁對照品貯備溶液0．1，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0 mL，置 10 mL 容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取10 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標、進樣量(X)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝195 516 X－110 924，R2＝0．999 0(n＝6)。結果表明，蘆丁進樣量在 6．21 ～62．10 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0．43%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果的 RSD為0．52%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，10 h 時測定峰面積。結果的 RSD 為 1．32%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品9份，每份0．25 g，分別精密加入對照品貯備溶液 10，12，15 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 藍刺頭總黃酮加樣回收試驗結果（n＝9）

2．2．4 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，結果測得藍刺頭藥材中總黃酮的含量為2．676 mg ／g。

2．3 提取工藝優選

2．3．1 正交試驗設計及結果

在預試驗基礎上，采用正交試驗優化提取工藝。選擇乙醇體積分數（因素A）、加醇量（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數（因素D）作為考察因素。各因素取3個水平，采用 L9(34)正交試驗表安排試驗，以總黃酮含量為評價指標。采用SPSS 12．0統計軟件進行數據處理，對試驗結果進行直觀分析和方差分析，篩選最佳工藝條件。結果見表2至表4。由表3可知，各因素影響提取效果的順序為D＞C＞B＞A。根據直觀分析，最佳提取工藝條件為A2B3C3D3，即加12倍量70%乙醇，提取3次，每次 2 h。

表2 L9（34）正交試驗因素水平表

表3 藍刺頭總黃酮提取工藝正交試驗結果

表4 方差分析結果

2．3．2 驗證試驗

為確定該工藝的優劣和穩定性，按優選工藝提取，對同一批樣品進行3次試驗。結果3批藍刺頭樣品中總黃酮 的 含量 分別為 2．676，2．899，2．727 mg ／g，平 均2．767 mg／g。可見，該提取工藝總黃酮含量高，重復性好，工藝穩定可行，實際操作簡單，適合工業化生產。

3 討論

本試驗研究結果顯示，采用乙醇為提取溶劑有多種影響因素。通過正交試驗結果表明，各因素對提取效果的影響順序為D＞C＞B＞A。通過直觀分析方法，篩選出最佳提取工藝條件為A2B3C3D3，即加12倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h。該方法藍刺頭中總黃酮提取率平均達0．27%，工藝穩定，且提取率高。

藍刺頭的主要固骨質有效成分為黃酮類化合物，關于藍刺頭中黃酮的含量測定方法很多，大多數使用紫外分光光度法測定總黃酮的含量。本研究中采用高效液相色譜法測定藍刺頭中總黃酮的含量，具有較好的靈敏性和準確度。不同產地的藍刺頭屬植物（禹州漏蘆）成分含量也存在一定差異[12]，其原因可能是受氣候或土壤等因素的影響，因此有必要對藍刺頭屬植物的生長環境進行考察，建立標準、規范的種植基地，從而確保藥材質量。

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