人巨細胞病毒UL133基因型在嬰幼兒肝功能損傷中的分子機制

溫正旺 陳敏 陳潔 石海礬 蔡曉紅 陳益平

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種引起嬰幼兒肝炎最常見的病原體[1]。HCMV肝炎占嬰幼兒肝炎綜合征的30%～40%或更高，臨床表現多樣（無癥狀的感染、膽汁淤積型肝炎甚至膽道閉鎖），尤其是亞臨床型肝炎最為常見，嚴重危害嬰幼兒的生命與健康。人群普遍感染HCMV，其特異性IgG抗體陽性率可高達90%[2]。國內流行病學調查發現，嬰幼兒HCMVIgG抗體陽性率為70%～90%[3]。為何有些嬰幼兒HCMV感染會導致HCMV肝炎呢？既往研究提示HCMV中含有數百個基因型，其中UL133基因型與嬰幼兒HCMV肝炎密切相關，但其具體的病理、生理機制尚不明確。本課題通過篩查HCMV肝炎患兒中病毒是否含有UL133基因型，并檢測血液中肝細胞損傷相關蛋白的表達，來探索HCMV UL133基因型對嬰幼兒肝功能損傷的分子機制。現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年1至12月本院收治的68例HCMV肝炎患兒和66例同期門診體檢肝功能正常且確診HCMV感染（尿液中可檢出HCMV包涵體）的患兒為研究對象。肝炎患兒中男38例，女30例；年齡（8.35±3.6）個月。體檢患兒中男34例，女32例；年齡（8.36±2.7）個月。肝炎患兒與體檢患兒性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究通過醫院倫理委員會審批，且患兒家屬知情同意。

1.2 尿液HCMV DNA的檢測 留取患兒尿液10ml，利用PCR擴增結合測序以及原位雜交技術，明確患兒尿液HCMV是否存在UL133基因型。RT-PCR引物購自上海基康生物工程有限公司。

1.3 血液 Caspase-3、Caspase-6蛋白表達的檢測Caspase-3和Caspase-6ELISA試劑盒購自美國Pepro－Tech公司；Caspase-3抗體、Caspase-6抗體購自英國Abcom公司。抽取患兒血液3ml，采用ELISA法檢測。向預先包被了Caspase-3、Caspase-6單克隆抗體的酶標孔中加入Caspase-3、Caspase-6，溫育；加入生物素標記的Caspase-3抗體、Caspase-6抗體，與鏈霉親和素-HRP結合形成免疫復合物，溫育，洗滌；去除未結合的酶，加入底物A、B，產生藍色；在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色深淺與Caspase-3、Caspase-6蛋白濃度有關，根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.4 觀察指標 觀察并比較患兒尿液中HCMV UL133基因型，血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平及肝功能指標。

1.5 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UL133基因型篩查結果 肝炎患兒尿液中UL133基因型篩查陽性率達94.1%，明顯高于體檢患兒的3.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。其中UL133基因型篩查陽性的64例肝炎患兒為UL133陽性組，UL133基因型篩查陰性的64例體檢患兒為UL133陰性組。

表1 UL133基因型篩查結果

2.2 兩組患兒血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較 UL133陽性組患兒血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平均明顯高于UL133陰性組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患兒血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較

2.3 兩組患兒肝功能指標比較 兩組患兒血AST、TBiL、DBiL、谷氨酰轉移酶（GGT）比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；UL133陽性組患兒血ALT明顯高于UL133陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患兒肝功能指標比較

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒β亞科，是一種廣泛分布的機會致病性病毒，具有潛伏活動的生物學特點。HCMV的自身DNA系列中含有免疫逃避基因，其基因組中含有人細胞因子及細胞因子受體的類似基因，可表達人細胞因子及細胞因子受體的類似物，從而干擾宿主自身的細胞因子系統；也能影響免疫系統，特別是抗原呈遞細胞的抗原呈遞功能，即通過下調人類白細抗原I的表達致使T細胞對抗原肽分子的識別受到抑制，同時CD4分子的共受體也相應受損，第一信號傳導障礙，抑制T細胞激活，從而逃避機體免疫系統的攻擊。HCMV感染可引起機體宿主細胞發生凋亡，而HCMV具有許多抗凋亡的機制和細胞毒性T細胞殺傷機制，使感染細胞長期存活；以上方式相互作用，使病毒感染后處于靜息平衡狀態；當機體免疫功能低下時，潛伏在體內的HCMV可激活，病毒大量復制，發生顯性感染。在臨床上，當HCMV感染肝細胞時，一部分患兒出現肝功能受損，表現為亞臨床型肝炎、黃疸型肝炎、無黃疸型肝炎、膽汁淤積型肝炎、膽汁淤積癥等，大部分患兒僅提示存在HCMV感染；同樣一種病毒感染，肝炎患兒并未表現出具有明顯差異的免疫功能損傷及低下，但臨床癥狀卻差異很大。HCMV感染可導致全身各系統組織器官發生損傷，但關于HCMV感染導致嬰幼兒長期黃疸的研究中，通過組織活檢以及免疫染色法，發現HCMV只存在于肝臟中，其他組織免疫染色都呈陰性[4]；且同一器官中，HCMV的靶細胞也存在特異性，即在HCMV肝炎中，HCMV主要感染肝細胞、血管內皮細胞及膽管上皮細胞，其他細胞中則檢測不出HCMV包涵體。因此，筆者提出一種假設，即HCMV基因系列中存在一些病毒親嗜性基因，以促進HCMV入侵肝細胞，從而導致HCMV肝炎的發生。因此，HCMV基因多態性的研究將有效揭示HCMV肝炎的肝損傷機制。

在人HCMV老鼠實驗模型中，對人HCMV UL/b′區基因片段功能進行分析，發現部分該區基因片段的丟失可導致病毒毒力的改變[5]；此外，HDAXX蛋白可以抑制HCMV即早基因的表達和病毒復制，但當HCMV UL82毒株感染機體后，分泌PP71蛋白，會減輕HDAXX的抑制作用[5]。研究發現UL83基因型對腦組織血管平滑肌AT受體的表達水平影響很大，它可以促進AT1受體的表達，同時抑制AT2受體[6]。某肝癌研究發現，HCMV感染后可以激活IL-6R-JAK-STAT3信號通路，同時促進肝癌細胞的增殖，提示HCMV感染參與了肝癌細胞內的基因表達[7]。Guo等[8]研究證實HCMV β區UL144、UL146基因型與新生兒肝功能損傷密切相關，揭示β區基因型在HCMV肝損害中起重要作用。Petrucelli等[9]研究提示HCMV β區UL133基因型與HCMV的侵襲能力有關，可能與HCMV肝炎的發生、發展密切相關，但具體分子機制尚未完全闡明。因此，本課題研究重點仍是HCMV β區UL133基因型，擬通過檢測血清中Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平，進一步探索UL133基因型與肝功能損傷的潛在分子機制，為HCMV肝炎的診斷與治療提供一個新的靶點。

對HCMV肝炎患兒尿液進行篩查發現，所感染的HCMV普遍攜帶UL133基因型；進一步檢測血清Caspase-3、Caspase-6蛋白表達，發現UL133陽性組與陰性組患兒的蛋白表達水平均明顯上調。然而，在體檢發現HCMV感染的患兒中，只有2例含有UL133基因型。此外，UL133陽性組患兒血液Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平均明顯高于UL133陰性組組。既往研究表明肝炎患者Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平上調可直接誘導細胞凋亡，從而導致肝功能損傷[10-11]。值得注意的是，UL133陽性組與陰性組除血ALT外，AST、TBiL、DBiL、GGT 比較差異均無統計學意義；但是個別肝炎患兒血TBiL是存在升高的，部分患兒存在肉眼黃疸；以上結果提示在HCMV感染導致肝功能損傷的病理、生理過程中，可能存在基因的協同與抑制作用。

綜上所述，攜帶有UL133基因型的HCMV感染嬰幼兒后，可直接誘導Caspase-3、Caspase-6蛋白表達上調，從而導致肝功能損傷；未攜帶有UL133基因型的HCMV感染嬰幼兒后，易處于潛伏感染狀態。本課題主要從內部揭示HCMV UL133基因型誘導肝功能損傷的病理、生理機制，為HCMV基因型與機體肝功能損傷的內在相關性提供分子理論依據；關于HCMV基因多態性中的基因協同與抑制作用，將在后續課題中進一步研究。

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