啶酰菌胺和咯菌腈復配對草莓灰霉病菌的室內毒力測定及田間防效

張 亞 劉 青 劉雙清 廖曉蘭，3*

（1湖南農業大學植物保護學院，湖南長沙 410128；2植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3湖南省生物農藥與農藥制劑加工工程技術研究中心，湖南長沙 410128）

草莓灰霉病是危害草莓生產的重要病害，每年由該病造成的經濟損失可達10%～30%，有的甚至高達89%（Ugolini et al.，2014）。該病的寄主范圍廣泛，不僅可以侵染草莓，而且還可侵染番茄、黃瓜、辣椒、葡萄等多種植物（Williamson et al.，2007；Zhang et al.，2014）。生產上防控草莓灰霉病的方法主要包括農業防治（清除病殘體、調控溫濕度、通風透光、紫外照射）、生物防治（以菌制菌）、化學防治（利用合成農藥）等，其中化學防治具有見效快、節約成本等優勢，一直是控制草莓灰霉病的重要方法（Rosslenbroich & Stuebler，2000；Huang et al.，2012；吉沐祥 等，2013；Shao et al.，2015；Aqueveque et al.，2016；Janisiewicz et al.，2016）。目前防治草莓灰霉病的化學藥劑主要有多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺等，但長期大量使用化學藥劑不僅污染土壤，破壞生態平衡，造成農藥殘留，而且容易使病菌產生抗藥性（Hunter et al.，1987；Yourman & Jeffers，1999；Dianez et al.，2002）。研究表明，草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威、嘧霉胺等藥劑已經產生了抗藥性，因此迫切需要通過復配技術降低草莓灰霉病菌的抗藥性，延緩藥劑的使用壽命（周明國等，1990；韓巨才 等，2004；陳莉 等，2007；禮茜 等，2007；陳仁 等，2015）。

啶酰菌胺是一種線粒體呼吸抑制劑，通過抑制線粒體電子傳遞鏈上琥珀酸輔酶Q還原酶活性達到控制病菌菌絲生長的作用，其作用機理與其他酰胺類和苯甲酰胺類殺菌劑類似（顏范勇 等，2008；馮小龍，2016）?？┚嫱ㄟ^抑制葡萄糖磷?；嘘P的轉移酶，最終導致病菌死亡，其作用機理獨特，與現有殺菌劑無交互抗性（楊玉柱和焦必寧，2007）。這兩種藥劑都是生產上常用于防治草莓灰霉病的化學藥劑，本試驗擬通過復配技術篩選出對草莓灰霉病菌具有增效作用的復合物，并進行田間防效試驗，旨在為今后防控草莓灰霉病提供用藥依據。

1 材料與方法

室內毒力測定和田間藥效評價于2016～2017年分別在湖南農業大學植物保護學院生物農藥工程中心和衡陽市衡東縣新塘鎮草莓種植示范基地進行。

1.1 試驗材料與藥劑

供試菌株為草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea），由湖南農業大學植物保護學院生物農藥課題組從發病的草莓病果上分離獲得純種菌株（劉雙清 等，2016）。

供試藥劑為98.51%啶酰菌胺原藥，購自上海秦巴化工股份有限責任公司；98%咯菌腈原藥，購自北京伊諾凱科技有限公司；50%啶酰菌胺可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.60 mg·mL-1），購自巴斯夫（中國）有限公司；50%咯菌腈可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.05 mg·mL-1），購自先正達（蘇州）作物保護有限公司；50%腐霉利可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.80 mg·mL-1），購自海南正業中農高科股份有限公司；乙醇、丙酮、吐溫-80、葡萄糖、瓊脂、NaOH、HCl等化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

參考方中達（1998）的方法配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）。

1.2 試驗儀器

ME204E分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司），Eppendorf移液槍（艾本德中國有限公司），LDZX-30E滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），YJ-VS-2型超凈工作臺（無錫一凈凈化設備有限公司），MPJ-250型培養箱（上海森信實驗儀器有限公司），電爐（北京中興偉業儀器有限公司）以及量筒、玻璃棒、燒杯、三角瓶、直尺、鉛筆、標簽紙、封口膜、挑針、容量瓶、接種針、打孔器、培養皿、菜刀、紗布等。

1.3 試驗方法

1.3.1 室內毒力測定 采用生長速率法測定藥劑對草莓灰霉病菌的抑制作用（凌金峰 等，2016）。取適量丙酮將啶酰菌胺和咯菌腈原藥溶解，制備成濃度為100 μg·mL-1的母液。將啶酰菌胺和咯菌腈分別按照 1∶1、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2：1、3∶2的質量比配成混合液，無菌水稀釋，并加入適量吐溫-80使藥劑均勻分布于水相中，將藥液與培養基按1∶9的體積比配制成最終含藥量為 0.001、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1的含藥平板，同時設無藥平板為對照。用打孔器在預培養48 h的菌落邊緣打取菌餅，正面朝下接種到含藥平板上，每處理3次重復，置于20 ℃培養箱中，黑暗培養72 h后，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑。計算各處理濃度的抑制率，并采用DPS6.55軟件的專業統計方法進行生物測定分析，明確啶酰菌胺、咯菌腈及其復配物的毒力回歸方程，EC50值和相關系數。試驗共進行2次。采用Wadley法進行增效作用評價（農業部農藥檢定所，2006）。當增效系數SR＞1.5為增效作用；0.5≤SR≤1.5為相加作用；SR＜0.5為拮抗作用。

式中：A、B分別代表兩種藥劑，a、b分別代表兩種藥劑在混劑中所占比例，ob為實際觀察值，th為理論值。

1.3.2 田間藥效試驗 田間試驗在湖南省衡陽市衡東縣新塘鎮草莓基地進行，選擇草莓灰霉病歷年發生均勻且發病較重的大棚，草莓品種為紅顏，株距30～38 cm，土壤肥力中等，草莓長勢均勻一致。試驗共設5個處理，50%啶酰菌胺可濕性粉劑（T1）、50%咯菌腈可濕性粉劑（T2）、50%啶酰菌胺可濕性粉劑和50%咯菌腈可濕性粉劑復配物（質量比為3∶1，該比例對草莓灰霉病菌的增效作用最明顯）（T3），以50%腐霉利可濕性粉劑為藥劑對照（CK1），清水作為空白對照（CK0）。每處理3次重復，共15小區，采用完全隨機排列，小區面積10 m2。采用輝騰3WBS-20A型背負式手動噴霧器均勻噴施藥劑，每小區施藥液750 mL左右。草莓普遍開花結果初期，病害發生前施藥3次，每次間隔7 d，并于第3次施藥后7～10 d，根據草莓灰霉病田間試驗標準調查復配物對草莓的藥害情況、病果率，計算防治效果。

1.4 數據分析

原始數據經Excel軟件進行初步處理，采用DPS6.55軟件的專業統計方法對室內毒力數據進行生物測定分析，獲得藥劑的EC50、回歸方程以及相關系數；采用DPS6.55軟件的試驗統計方法對田間防效數據進行單因素完全隨機方差分析，明確不同藥劑處理之間差異。

2 結果與分析

2.1 啶酰菌胺與咯菌腈復配對草莓灰霉病菌的抑制作用

由表1可知，啶酰菌胺和咯菌腈均對草莓灰霉病菌具有抑制作用，其中咯菌腈的毒力高于啶酰菌胺，其抑制中濃度遠低于啶酰菌胺。當咯菌腈的含量≥啶酰菌胺時，其在復配物中所占的比例越高，增效系數越低：當啶酰菌胺和咯菌腈復配比例為1∶1時，表現增效作用；當啶酰菌胺和咯菌腈復配比例為1∶3、1∶4、1∶5時，均表現相加作用。當啶酰菌胺和咯菌腈復配比例為3∶2、2：1、3∶1、5∶1時均表現增效作用，但比例為4∶1時則表現相加作用，這可能跟菌株在培養箱中放置的位置有關。3∶1復配的增效系數為4.47，增效作用最明顯。

2.2 啶酰菌胺與咯菌腈復配對草莓灰霉病的田間防治效果

由表2可知，啶酰菌胺和咯菌腈按照質量比3∶1復配（T3）可以顯著降低草莓灰霉病的發病率，對草莓灰霉病具有較好的控制效果，兩年防效均達70%以上，顯著高于腐霉利的藥劑對照。經過田間觀察發現，無論是復配物還是單劑均未對草莓正常生長產生不利影響。

表1 啶酰菌胺和咯菌腈復配對草莓灰霉病的室內毒力測定

表2 啶酰菌胺與咯菌腈復配對草莓灰霉病的防治效果

3 結論與討論

草莓灰霉病菌適合度高、變異大、繁殖速度快，是高抗風險的病原物，已對多種農藥產生了抗性（陳治芳 等，2010）。將作用機理不同的農藥進行復配對延緩草莓灰霉病菌抗藥性具有重要意義。本試驗首次將啶酰菌胺和咯菌腈兩種作用機理不同的藥劑進行復配，結果表明啶酰菌胺和咯菌腈以質量比3∶1復配對草莓灰霉病菌的增效作用最明顯，這個結果不僅有助于延長兩種藥劑的使用壽命，而且豐富了防治草莓灰霉病的新藥劑。啶酰菌胺和咯菌腈復配時，咯菌腈的量與增效系數呈反比，但啶酰菌胺的量與增效系數無明顯規律，與趙建江等（2016）的研究結果一致。這一現象可能與Wadley計算方法有關。本試驗結果表明，無論啶酰菌胺和咯菌腈如何復配，其對草莓灰霉病菌都具有相加作用或增效作用，說明二者復配協同效果較好，具有開發潛力，可進一步研制劑型，創制新的農藥品種。

本試驗僅研究了啶酰菌胺和咯菌腈復配物對草莓灰霉病菌的防治效果，而這兩種藥劑對其他病原菌，如疫霉病菌、炭疽病菌、紋枯病菌、黃萎病菌等是否也具有增效作用，值得進一步研究。目前，復配物的增效機理普遍認為是一種藥劑干擾了病原菌對另一種藥劑的解毒和代謝作用（畢秋艷和馬志強，2010）。本試驗暫未考察啶酰菌胺和咯菌腈復配物的增效機理，究竟是啶酰菌胺還是咯菌腈首先發揮作用，或是兩者是否同時發揮作用等，也有待今后研究。

一種農藥能否用于生產，必須要進行室內生物活性測試和田間試驗。本試驗兩年的田間試驗結果表明：啶酰菌胺和咯菌腈復配對草莓灰霉病的最佳防效可達74.40%，優于單一施用的效果。研究表明，復配物暗羅-丁子香酚對草莓灰霉病的田間防效為73.91%（吉沐祥 等，2009）；施用腐霉利7 d對草莓灰霉病的防效為68.05%（張頌函 等，2015）；復配物氟菌-肟菌酯對草莓灰霉病的防效低于70%（武雯 等，2015）。本試驗復配藥劑的防效高于前人的研究結果。此外，啶酰菌胺和咯菌腈兩種藥劑已有成熟的合成技術，原材料獲得方便，價格適中，操作簡單，節省勞力等，為今后的復配研究奠定了物質基礎。綜合以上幾點，啶酰菌胺和咯菌腈復配具有開發和應用的潛力，未來可以在生產上推廣應用。

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