葉用萵苣磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsPHT1基因的克隆及其在納米材料處理下的表達(dá)

汪玉潔 陳日遠(yuǎn) 劉厚誠(chéng) 宋世威 蘇 蔚 孫光聞

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，在能量代謝、糖分代謝、酶促反應(yīng)和光合作用等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，且是核酸、植素和卵磷脂的重要組成成分，在很大程度上決定了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)（Lynch & Beebe，1995）。目前已報(bào)道的高等植物中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要有4個(gè)家族：PHT1、PHT2、PHT3和 PHT4（Poirier &Bucher，2002；Guo et al.，2008），每個(gè)家族分別含有不同數(shù)量的成員。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白根據(jù)Km值可以分為低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（low affinity）和高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（high affinity）兩大類（Raghothama，1999；Gordonweeks et al.，2003）。近年來(lái)通過(guò)基因組測(cè)序和同源基因克隆等技術(shù)手段，從苜蓿、水稻、擬南芥、小麥、大麥、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、辣椒、茄子、百脈根、矮牽牛等的基因組中鑒定到多個(gè)編碼高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（張曉，2014）。這些基因大多數(shù)屬于共轉(zhuǎn)運(yùn)體的PHT1家族，可能具有吸收土壤溶液中低濃度可溶性磷和在植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)墓δ埽↙in et al.，2009）。通過(guò)不同的生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，PHT1家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性（李立芹，2011）。大多數(shù)植物的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在根部表達(dá)，有的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受缺磷誘導(dǎo)，有的則受菌根誘導(dǎo)，并且具有很高的特異性（Bucher，2007；Jain et al.，2007），這充分說(shuō)明了根系對(duì)植物磷素吸收和利用的重要性。

納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末誕生并崛起的高科技，對(duì)世界經(jīng)濟(jì)、工業(yè)和人們的生活產(chǎn)生了非常重要的影響。隨著納米材料研究的深入，其在植物上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。越來(lái)越多的研究表明，納米材料能在一定程度上改善植株的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。噴施相同含硅量的納米硅藻土、納米二氧化硅后，莧菜干物質(zhì)量分別比對(duì)照提高43.4%和14.9%，氮磷鉀吸收總量分別提高36%和20%（裴福云 等，2015）。納米碳的加入還能提高土壤中堿解氮、速效磷、速效鉀的含量，并促進(jìn)玉米對(duì)N、P、K等養(yǎng)分的積累（王佳奇，2013）。劉秀梅（2005）研究表明，納米—亞微米級(jí)復(fù)合材料能提高作物對(duì)褐潮土、紅壤和風(fēng)沙土中氮、磷、鉀的吸收和利用，植株干質(zhì)量及氮、磷、鉀含量均顯著高于對(duì)照。

南方蔬菜生理與設(shè)施研究中心在前期關(guān)于納米材料對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)發(fā)育的生理研究中，發(fā)現(xiàn)納米材料可以顯著增加根系對(duì)N、P、K、Zn及地上部對(duì)N、P、K、Ca的吸收（李貴蓮 等，2015；蘇蔚等，2015），并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Wang et al.，2017）。在分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)與磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的unigenes在處理中上調(diào)表達(dá)，因此本試驗(yàn)首先從葉用萵苣中克隆LsPHT1基因全長(zhǎng)，對(duì)基因序列及其翻譯的氨基酸序列進(jìn)行分析；并對(duì)葉用萵苣進(jìn)行納米材料處理，結(jié)合半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)納米材料處理下LsPHT1基因表達(dá)量，探討LsPHT1參與葉用萵苣響應(yīng)納米材料的作用特性，以期為進(jìn)一步研究納米材料影響葉用萵苣生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

供試葉用萵苣（Lactuca sativaL.）品種為耐抽薹意大利生菜，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，2015年10月13日在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院714培養(yǎng)箱內(nèi)催芽；種子萌芽后播于裝有珍珠巖的穴盤中，三葉一心時(shí)選擇均勻一致的幼苗移栽至裝有30 L 1/2 Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液的水培箱中。供試納米材料為廣州市富陽(yáng)環(huán)保科技有限公司和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新肥料研究資源中心研制生產(chǎn)的納米膠片，主要成份是TiO2和ZnO，涂布于塑料片上，面積為14 cm×12 cm。

試驗(yàn)按每升營(yíng)養(yǎng)液中使用納米膠片的面積設(shè)置2個(gè)處理：CK，無(wú)納米膠片（0 cm2·L-1）；T，1/2片納米膠片（2.80 cm2·L-1）。每處理18株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。移栽后第25天，隨機(jī)采集3株未經(jīng)納米處理的葉用萵苣植株，分別將葉片和根系用液氮處理（樣品速凍t≥1 min）后-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取和基因克隆；納米材料處理后第2、5、10、16、22、28、31、34天，分別于上午9：00隨機(jī)選取3株葉用萵苣植株，分別將葉片、根系用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于目標(biāo)基因的表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)試劑

Trizol試劑、所有引物合成及測(cè)序工作均由Invitrogen公司完成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real-time）、RACE試劑盒3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase、DNA marker、PMD18-T 載體、SYBR Premix ExTaqMix購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；用于DNA擴(kuò)增的2×SuperStar PCR Mix購(gòu)自Genestar公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用Trizol法提取總RNA，利用核酸蛋白儀Nanodrop 2000測(cè)定OD260和OD280，根據(jù)OD260/OD280比值判斷RNA的質(zhì)量，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以樣品中的1 μg總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）的模板。

1.4 LsPHT1基因克隆及序列拼接

采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）法克隆LsPHT1基因全長(zhǎng)cDNA。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得葉用萵苣磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的片段，根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)用于3′RACE的片段特異性引物（表1），其余操作完全按照RACE試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。利用DNASTAR軟件將擴(kuò)增得到的目的基因片段進(jìn)行拼接，獲得全長(zhǎng)cDNA。根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)特異引物PHT1-F和PHT1-R，擴(kuò)增該基因的編碼區(qū)序列（coding sequences，CDs），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，與PMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后選取陽(yáng)性克隆，送賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司測(cè)序。擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序后與拼接序列進(jìn)行比對(duì)，最終證實(shí)獲得葉用萵苣磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsPHT1基因全長(zhǎng)。

表1 試驗(yàn)所需引物序列

1.5 基因表達(dá)分析

納米材料處理后的葉用萵苣葉片和根系的總RNA提取方法同上。以葉用萵苣CAB作為內(nèi)參基因，半定量RT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2.0 μL，10×buffer（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs Mixture（10 mmol·L-1）0.4 μL，TaqDNA polymerase（2 U·μL-1）0.2 μL，Primer-F 和 Primer-R（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。qRTPCR反應(yīng)在CFX96 Real-Time PCR Detection System（BioRad公司）擴(kuò)增儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)體系為（10 μL）：SYBR Premix ExTaqMix 5 μL，cDNA（30～35 ng·μL-1）4 μL，正向引物和反向引物的混合物（10 μmol·L-1）1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán)；65 ℃加熱至 95 ℃，5 s。

1.6 序列分析

核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/）進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)（BLASTn）、氨基酸序列比對(duì)（BLASTp）和保守域預(yù)測(cè)；利用ProtParam程序（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測(cè)該氨基酸序列的分子量和理論等電點(diǎn)（pI）；利用 SignaIP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；利用 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線分析基因亞細(xì)胞定位；利用TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜分析；利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 LsPHT1的cDNA克隆

采用Trizol法提取總RNA，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間；采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，18 S和28 S兩條核糖體清晰，質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)已獲得的葉用萵苣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以葉用萵苣cDNA為模板，利用特異性引物GSP1和GSP2進(jìn)行半巢式3′RACE擴(kuò)增，獲得1條大小為703 bp的cDNA片段（圖1-a）。根據(jù)所得序列拼接后的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)，得到大小為1 605 bp的基因片段（圖1-b）。

圖1 LsPHT1的PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 LsPHT1序列分析

通過(guò)DNASTAR軟件分析得到1個(gè)cDNA的全長(zhǎng)為1 884 bp，具有1個(gè)完整的開放閱讀框，共1 605 bp，編碼534個(gè)氨基酸（圖2）。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因的核苷酸序列與菊花（登錄號(hào)：KC812501.1）同源性為81%，與煙草（登錄號(hào)：XM_009766934.1）同源性為75%，推測(cè)克隆獲得的基因?yàn)槿~用萵苣磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為L(zhǎng)sPHT1，序列已提交NCBI，登陸號(hào)為KY305670。

利用ProtParam程序預(yù)測(cè)該氨基酸序列分子量為58.5 kD，理論pI值8.68。推測(cè)該蛋白分子式為。推導(dǎo)的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為38.35，屬于穩(wěn)定蛋白；親水性/疏水性分析顯示，疏水區(qū)域明顯大于親水區(qū)域，說(shuō)明疏水性較強(qiáng)，為疏水性蛋白。利用SignaIP檢測(cè)該蛋白不含信號(hào)肽序列，無(wú)分泌蛋白；存在11個(gè)跨膜區(qū)，屬于跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明主要定位在細(xì)胞膜上。通過(guò)NPS程序?qū)Φ鞍仔蛄羞M(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，LsPHT1蛋白由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件組成，其中α螺旋所占比例最高，為53.00%；其次為無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，分別為35.96%和11.05%。對(duì)推測(cè)的LsPHT1氨基酸序列進(jìn)行保守域分析，顯示該序列包含1個(gè)從第25位氨基酸到504位氨基酸的保守域MFS superfamily和PHT1家族的保守特征序列：GGDYPLSATIxSE。

圖2 LsPHT1 cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列

利用DNAMAN軟件與其他植物的PHT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，表明該基因與擬南芥、番茄、菊花、葡萄等多種植物的PHT高度同源（圖3），其中與菊花氨基酸序列（登錄號(hào)：AGK29560.1）同源性高達(dá)88%，與葡萄氨基酸序列（登錄號(hào)：XP_010650086.1）同源性高達(dá)80%，充分說(shuō)明植物體內(nèi)PHT的高度保守性。

為進(jìn)一步了解葉用萵苣PHT和其他植物之間的親緣關(guān)系，利用軟件MEGA 5.0，通過(guò)NCBI Blast比對(duì)，將LsPHT1序列推測(cè)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的9種PHT氨基酸序列構(gòu)建（bootstrap）系統(tǒng)進(jìn)化樹。從氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出（圖4），該基因與菊花PHT親緣關(guān)系最近，二者同屬于菊科植物；與番茄的同源關(guān)系較近。

圖3 LsPHT1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖4 LsPHT1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 LsPHT1基因表達(dá)特性分析

以葉用萵苣根系和葉片第一鏈cDNA為模板，以LsCAB為內(nèi)參基因，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，LsPHT1僅在根部表達(dá)，在葉片中表達(dá)微弱（圖5）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相似，LsPHT1同樣只在葉用萵苣根部有較高的表達(dá)，而在葉片中的表達(dá)量極低（圖6）。

從圖7可以看出，在葉用萵苣全生長(zhǎng)期內(nèi)，LsPHT1基因的表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；在納米材料處理第22天（即11月23日），該基因的表達(dá)量達(dá)到最大值。在生長(zhǎng)中后期，納米材料處理的葉用萵苣根部LsPHT1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，說(shuō)明該基因的表達(dá)受納米材料的誘導(dǎo)上調(diào)。

圖6 LsPHT1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

圖7 葉用萵苣不同生長(zhǎng)時(shí)期根部LsPHT1的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

磷是植物體內(nèi)核酸、磷脂和ATP的重要組成成分，并且作為植物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)移物質(zhì)，能夠活化體內(nèi)蛋白質(zhì)，調(diào)控植物體內(nèi)的整個(gè)代謝過(guò)程（Marschner，1995）。植物中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是一個(gè)小基因家族，具有高度的保守性（王萍 等，2006）。根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km，高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Km值在7 μmol·L-1左右，而低親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Km值在50～330 μmol·L-1之間（Schachtman et al.，1998）。絕大部分已經(jīng)克隆出來(lái)的植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)儆贖+/H2PO4-共轉(zhuǎn)運(yùn)體的PHT1家族，都屬于高親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，即利用質(zhì)膜上的氫離子濃度梯度來(lái)驅(qū)動(dòng)植株對(duì)磷素的吸收，后者又歸屬于一個(gè)更大的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族MFS（Raghothama，2000），這一家族的基因負(fù)責(zé)磷吸收和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基本過(guò)程。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有著關(guān)鍵的相似性，都是膜整合蛋白，由12個(gè)疏水的跨膜區(qū)域組成（Robards & Lucas，1988）。本試驗(yàn)成功克隆了葉用萵苣的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為L(zhǎng)sPHT1。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行保守域分析顯示，該序列包含MFS超家族的保守結(jié)構(gòu)域和PHT1家族的保守特征序列：GGDYPLSATIxSE（李立芹，2011）。對(duì)其進(jìn)行跨膜分析顯示，葉用萵苣磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在跨膜數(shù)上與其他植物略有不同，據(jù)研究，玉米（Zea mays）磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmPT1～ZmPT9（ZmPT5除外）的跨膜區(qū)域數(shù)量在4～6個(gè)之間（張立軍，2011），小麥（Triticum aestivum）磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaPT1～TaPT11的跨膜區(qū)域數(shù)量在3～15個(gè)之間（鄭飛，2009），而LsPHT1蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)有11個(gè)，這說(shuō)明在植物演化過(guò)程中跨膜區(qū)域的數(shù)量出現(xiàn)了變化（曹慶芹 等，2013）。綜合氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，LsPHT1均與菊花PHT基因同源性最高，因此推測(cè)該基因?qū)儆谥参颬HT基因家族成員。LsPHT1基因的獲得，將有助于進(jìn)一步研究葉用萵苣響應(yīng)納米材料的作用機(jī)制，深入了解納米材料處理下葉用萵苣對(duì)磷素吸收的機(jī)理。

納米材料發(fā)射出遠(yuǎn)紅外射線（周延懷和馮玉英，2000），使水由大分子團(tuán)變?yōu)樾》肿訄F(tuán)，其溶解力、pH等性質(zhì)發(fā)生變化，經(jīng)納米材料處理的水具有較高的溶解力，磷溶解力的提高對(duì)于作物磷營(yíng)養(yǎng)有明顯的影響（曹玉江 等，2006）。納米材料處理對(duì)植物的磷素吸收有促進(jìn)作用這一結(jié)論在本試驗(yàn)前期工作（Wang et al.，2015）以及許多植物的生理試驗(yàn)上已經(jīng)得到驗(yàn)證。本試驗(yàn)中，納米材料處理的葉用萵苣全生長(zhǎng)期內(nèi)，LsPHT1基因的表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；在處理后第22天，該基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，這可能是由于隨著時(shí)間的變化，水培箱中的磷素逐漸被消耗，在缺磷條件下植物主要通過(guò)活化介質(zhì)中的磷并提高介質(zhì)中有效磷的吸收能力來(lái)適應(yīng)低磷脅迫（張斌和秦嶺，2010），即植株需通過(guò)上調(diào)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)來(lái)獲得生長(zhǎng)所需的磷素。在葉用萵苣生長(zhǎng)中后期，納米材料處理的植株根部LsPHT1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，表明納米材料能夠誘導(dǎo)LsPHT1的表達(dá)。

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