基質(zhì)金屬蛋白酶-2在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其分子探針體外磁共振成像的檢測

孫艷,沈靜,單煜恒,鐘士江

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心，天津 300162;2.中國人民武裝警察部隊安徽總隊醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性人腦腫瘤中的一類惡性疾病，罹患者大多不到5年的生存率，惡性程度高。膠質(zhì)瘤的治療是世界醫(yī)學(xué)難題。雖然近年來從手術(shù)、化療與放療等手段治療腦膠質(zhì)瘤取得很大進(jìn)展，但并未顯著提高其治療效果，很大一部分原因是由于其發(fā)病部位位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且其相當(dāng)一部分會浸潤遷移至外周組織[1]。西醫(yī)治療(手術(shù)、放療、化療)很難達(dá)到治愈與控制復(fù)發(fā)的目的，因此需要了解膠質(zhì)瘤侵襲的分子機(jī)制，特別是其在臨床應(yīng)用的重要價值。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種結(jié)構(gòu)中含有鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶類，主要分解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶類成分，包括發(fā)育、組織塑形、炎癥、退行性疾病、腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成等生理病理過程。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要亞型[2]。當(dāng)過表達(dá)MMP2時，能促進(jìn)不同腫瘤的轉(zhuǎn)移，特別是膠質(zhì)瘤中的轉(zhuǎn)移情況。因此有關(guān)MMP2的研究就顯得相當(dāng)重要。但是有關(guān)MMP2和膠質(zhì)瘤的分子研究和影像學(xué)研究還需更進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人U251、U373及大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫，星形膠質(zhì)細(xì)胞系(RA)購自于上海中國科學(xué)研究院細(xì)胞所。

1.1.2 主要試劑與儀器 (1)試劑：BIO-r-C磁性氧化鐵納米顆粒(USPIO)以Fe3O4為核心，pH值呈中性，其Fe的濃度為3.5 mg/mL，購買自北京萬德高科技發(fā)展有限公司。合成USPIO-PEG-MMP2Ab分子探針由廣州銳博生物公司合成。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)、N-羧基琥珀酰亞胺(NHS)；DMEM高糖培養(yǎng)基及FBS胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒(Perls stain,核固紅法)購于康為世紀(jì)(北京)有限公司。(2)儀器：電子顯微鏡(JEM-100CXⅡ，日本)；動態(tài)光散射納米粒度儀(Malvern Mastersizer2000，英國)；酶標(biāo)儀(Eppendorf，德國)；3.0T磁共振掃描儀(Philip，荷蘭)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代和貯藏 人U251、U373及大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、星形膠質(zhì)細(xì)胞系(RA)用DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(10%FBS，1%雙抗，1%谷氨酰胺)培養(yǎng)在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底的80%～90%時用胰蛋白酶法消化傳代。

1.2.2 免疫印跡 RIPA細(xì)胞裂解液提取三種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，后與蛋白等比例加入SDS Loading Buffer，煮沸10 min，進(jìn)行電泳并半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入抗MMP2兔多克隆抗體(1：500)及兔抗人β-action抗體(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗5次，8 分鐘/次，加入含5%脫脂奶粉的封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗5次，8分鐘/次，滴入顯影液，凝膠成像儀下曝光顯影并采集圖像，以β-actin為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次，使用Image Lab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。

1.2.3 合成USPIO-PEG-MMP2Ab探針 吸取USPIO-PEG(1 mg，3.5 mg Fe/mL)加入2 mL EP管中，稱取1 mg EDC及2.8 mg sulfo-NHS，加入100 μL去離子水溶解后，迅速轉(zhuǎn)移至USPIO-PEG溶液中，在室溫下反應(yīng)15 min，采用PD-10交換柱對活化后的USPIO-PEG進(jìn)行緩沖液交換，洗脫液采用NaHCO3(0.1 M)，然后加入1mg MMP2Ab在室溫下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，4 h后，PBS緩沖液進(jìn)行透析并過夜，偶聯(lián)完畢后，將偶聯(lián)物置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆茫褂们坝脽o菌PBS洗2次，1次5 min。

1.2.4 噻唑藍(lán)(MTT)比色法 取對數(shù)期生長的RA細(xì)胞，以每孔2×104細(xì)胞均勻接種至96孔板，完全培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀釋的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL用PBS配制pH=7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，水平離心機(jī)離心后小心棄去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，避光置于微量振蕩器震蕩15 min，在酶標(biāo)儀下讀取490 nm處吸光度值。

1.2.5 普魯士藍(lán)檢測 取對數(shù)期生長的C6細(xì)胞，以每孔5×104細(xì)胞均勻接種至24孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，PBS清洗2遍。加入200 μL USPIO-PEG-MMP2Ab、BSA、BSA-USPIO，4 ℃孵育2 h后PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min,每孔加入Perls stain 200μL，室溫靜置30 min后PBS清洗3遍，核固紅復(fù)染5 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察。

1.2.6 體外細(xì)胞磁共振成像 取對數(shù)期生長的C6細(xì)胞，以每孔2.5×105細(xì)胞均勻接種至12孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀釋的USPIO-PEG及Ab-MMP-2-USPIO(10、20、30、40、50 μg Fe/mL)500 μL，另設(shè)置空白對照組。37 ℃培養(yǎng)2 h后，胰酶消化離心，200 μL 1%的低熔點瓊脂糖溶液重懸后加入96孔板中，迅速置于4 ℃得到細(xì)胞均勻分布的瓊脂糖凝膠。采用(Philip，Aachieva 3.0T)及人頭線圈行軸位及冠狀位掃描，掃描參數(shù)設(shè)置如下。T2WI：TR(repetition time)3000 ms，TE(echo time)15 ms，F(xiàn)OV(field of view)180 mm，層厚1.5 mm，層間距：0.5 mm，矩陣180×142，感興趣區(qū)(ROI)11.5 mm2。每組取不同層面各測量3次，信號強(qiáng)度(SI)下降計算公式如下：SI下降水平=SI空白-SI測定。

2 結(jié)果

2.1 Western-Blot檢測不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中MMP2表達(dá)水平 以RA細(xì)胞(0.50±0.21)作為對照，結(jié)果顯示MMP2在U251(2.19±0.56)、U373(1.65±0.42)、C6(2.31±0.76)均高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 MTT比色法檢測USPIO-PEG及對細(xì)胞生存的影響 RA細(xì)胞與不同濃度的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)孵育24 h后細(xì)胞存活率見表1。在磁共振應(yīng)用的有效濃度范圍內(nèi)(≤50 μg Fe/mL)，USPIO-PEG-MMP2Ab對細(xì)胞存活率無顯著影響，提示其無明顯細(xì)胞毒性(P>0.05)；當(dāng)濃度升至100 μg Fe/mL時，細(xì)胞存活率顯著降低，提示存在一定的細(xì)胞毒性(P<0.01)。

表1 MTT檢測不同F(xiàn)e濃度的分子探針對RA細(xì)胞存活的影響

注：與Fe濃度為0組比較，aP<0.01

2.3 USPIO-PEG-MMP2Ab與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的結(jié)合

C6細(xì)胞與USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后的普魯士藍(lán)染色見圖1。細(xì)胞內(nèi)藍(lán)染顆粒較多，主要分布于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。在相同濃度及孵育時間的條件下，USPIO-PEG-MMP2Ab組的藍(lán)染顆粒較USPIO-PEG組更多、更明顯。

圖1 USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab與C6細(xì)胞

2.4 USPIO-PEG-MMP2Ab的體外磁共振成像 C6細(xì)胞與不同濃度的USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab(0、10、20、30、40、50 μg Fe/mL)孵育2 h后細(xì)胞的SI值均出現(xiàn)下降。在相同濃度下，USPIO-PEG-MMP2Ab組細(xì)胞的SI值下降水平明顯高于USPIO-PEG組細(xì)胞(P<0.01)(見表2)。

表2 C6與USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后磁共振成像SI下降值

注：在相同濃度下，USPIO-PEG-MMP2Ab組細(xì)胞的SI值下降水平明顯高于USPIO-PEG組細(xì)胞，aP<0.01

3 討論

腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的20%，其生長過快和浸潤性較強(qiáng)的特點造成了其預(yù)后差[3]。MMPs在惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，參與了細(xì)胞外基質(zhì)和新血管的重構(gòu)，這主要由于其對底物的親和性，即膠原Ⅳ，纖連蛋白，蛋白聚糖，他們被分泌出來時是處于未激活狀態(tài)[4-5]，這一激活過程是通過基質(zhì)金屬蛋白酶或者絲氨酸蛋白酶來完成。惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性生長需穿過由基底膜和間質(zhì)成分構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)，基底膜主要由Ⅳ型膠原蛋白構(gòu)成，而間質(zhì)則主要由Ⅰ型膠原蛋白構(gòu)成。絕大部分腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生降解Ⅳ型膠原蛋白的酶。近年來腫瘤基因?qū)W治療的發(fā)展隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展亦有較大進(jìn)步。有研究報道MMP9和MMP12參與腫瘤的轉(zhuǎn)移[6-8]。膠質(zhì)瘤的形成和轉(zhuǎn)移與基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的MMP2有關(guān)，但是有關(guān)MMP2在膠質(zhì)瘤中的分子機(jī)制還未被研究[9-10]。MMP2參與腫瘤的分子機(jī)制可能是通過：(1)通過降解癌細(xì)胞或者癌巢周圍細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移停工良好的環(huán)境；(2)在降解細(xì)胞外基質(zhì)的的同時促進(jìn)血管表皮生長因子，轉(zhuǎn)錄生長因子等的釋放，通過釋放這些血管生長和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的因子進(jìn)而到促進(jìn)癌細(xì)胞生長的目的[11-12]。最近有文獻(xiàn)報道MMP2和MMP9與腦出血有關(guān)系，該研究表示MMP2/MMP9可能促進(jìn)了出血后血管源性腦水腫的形成[13-14]。但是其模型是在誘導(dǎo)小鼠形成水腫基礎(chǔ)上進(jìn)行研究的，所以在臨床上具有一定的參考價值，并沒法說明其實用性。MMP2在影像學(xué)中的研究多集中在其是否在臨床患者中的表達(dá)情況，其具體研究機(jī)制還未清楚。

本實驗首先證實了在多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(包括人源性和鼠源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)中，均高表達(dá)MMP2，但是在對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞系中其表達(dá)明顯低于其他腫瘤細(xì)胞，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而后，本研究利用碳二亞胺法將MMP2的抗體與超順磁性氧化鐵納米顆粒偶聯(lián)合成新型磁共振分子探針USPIO-PEG-MMP2Ab，且對其細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖未受影響，緊接著通過普魯士藍(lán)染色及體外磁共振成像驗證了新型磁共振分子探針同MMP2高表達(dá)的C6細(xì)胞的靶向能力，在與單純多肽對照組相比，MMP2靶向性更好(P<0.05)。

本研究顯示，MMP2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，分子影像學(xué)研究表明USPIO探針對高表達(dá)MMP2的膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有靶向性，為今后在體實驗進(jìn)一步驗證該磁共振分子探針的成像效果，為其應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤早期無創(chuàng)性診斷奠定基礎(chǔ)。

[1] DAVID LS,SHIDENG B,JEREMY NR.Genomics informs glioblastoma biology[J].Nature Genetics,2013,45(10):1105-1107.

[2] 吳文斌,胡長林,李國秧,等.腦內(nèi)血腫吸收機(jī)制中相關(guān)因素的分析[J].現(xiàn)代康復(fù),2000,4(4):581-583.

[3] DAVIDSON B,REICH R,RISBERG B,et al.The biological role and regulation of matrix metalloproteinases (MMP) in cancer[J].Arkh Patol,2002,64(1):47 -53.

[4] SONG H,LI Y,LEE J,et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 promotes cancer cell migration and invasion by inducing the expression of matrix metalloproteinases 2 and 9[J].Cancer Res,2009,69(3):879-886.

[5] 石建霞,顧健.凝血酶與腫瘤的血管新生[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2006,14(1):197-200.

[6] ROMERO S,MARTINEZ A,HEMANDEZ L,et al.Light scriteria revisited consistency and comparison with new proposed alternative criteria for separating pleural transudates from exudates[J].Respiration,2013,67(1):18-23.

[7] LUO Y,LIANG F,ZHANG ZY.PRL1 promotes cell migration and invasion by increasing MMP2 and MMP9 expression through Src and ERK1/2 pathways[J].Biochemistry,2009,48(8):1838-1846.

[8] YEUNG YT,MCDONALD KL,GREWAL T,et al.Interleukins in glioblastoma pathophysiology:implications for therapy[J].Br J Pharmacol,2013,168(3):591.

[9] 李京佳,林相國,許濤,等.VEGF家族及其在腫瘤生長中作用的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(4):777-779.

[10] HUANG JL,WU SY,XIE XJ,et al.Inhibiting effects of le flunomidemet aboliteon overexpression of CD147,MMP-2 and MMP-9 in PMA differentiated THP-1 cells[J].Eur J Pharmacol,2011,67(1):304-310.

[11] LI R,LI G,DENG L,et al.IL-6 augments the invasiveness of U87MG human glioblastoma multiforme cells via up-regulation of MMP-2 and fascin-1[J].Oncol Rep,2010,23(6):1553-1559.

[12] ZHU GE Y,XU J.Rac1 mediates type I collagen-dependent MMP-2 activation.role in cell invasion across collagen barrier[J].J Biol Chem,2001,276(19):16248-16256.

[13] 印弘,李復(fù),高元桂,等.大鼠C6膠質(zhì)瘤VEGF表達(dá)與MRI對照研究[J].中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2001,10(3):200-202.

[14] LI S,GAO Y,MA W,et al.EGFR signaling-dependent inhibition of glioblastoma growth by ginsenoside Rh2[J].Tumour Biol,2014,35(1):5593-5598.