淫羊藿苷對大鼠精子質量和精核蛋白作用的影響*

葛 斌，石 燕，王露娟（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563000）

雄性生殖系統(tǒng)損害導致的不育癥已普遍受到國內外學者關注[1]。精核蛋白（TNBP）是一種與雄性生育能力密切相關的堿性蛋白質，大鼠精核蛋白（RP）含量在反映精子質量方面有著重要意義[2]。淫羊藿苷（ICA）作為一種傳統(tǒng)中藥，可以抑制生精細胞凋亡、促進睪酮分泌并提高陰莖海綿體鳥苷環(huán)磷酸（cGMP）水平。本研究通過觀察不同劑量ICA對大鼠精子質量和TNBP表達的影響，探索ICA在治療不育癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠80只，體重210～235 g，由第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院動物中心提供。合格證編號：20150017，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學院實驗動物中心，溫度：25℃，濕度：50%。

1.1.2 實驗試劑 腺嘌呤由上海遠幕生物科技有限公司提供；ICA由南京澤朗生物有限公司提供，純度大于或等于98%。

1.1.3 分組 將80只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、ICA低劑量組、ICA高劑量組，每組20只。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 對照組：蒸餾水3 mL灌胃60 d；模型組：腺嘌呤25 mg/100 g和用蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以蒸餾水3 mL灌胃30 d；ICA低劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d，再以ICA 1.8 g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d；ICA高劑量組：先用腺嘌呤25 mg/100 g和蒸餾水3mL配置后灌胃30d，再以ICA3.6g/kg和蒸餾水3 mL配置后灌胃30 d。

1.2.2 附睪精液采集和測定 按照文獻[3]方法處死大鼠、采集精液，在37℃恒溫水浴箱液化10 min后置于精子全自動分析儀上測定。

1.2.3 精子堿性蛋白提取及電泳 按照文獻[2]方法提取堿性蛋白，在酸性-尿酸系統(tǒng)中進行電泳分析，結果掃描測量條帶數(shù)值，總堿性蛋白（TH）/RP比值代表TNBP相應含量。

1.2.4 觀察指標 精子密度：每毫升精液的精子數(shù)；精子活率：活動精子/精子總數(shù)；精子活力：前向運動精子數(shù)/精子總數(shù)；TNBP相應含量：TH/RP。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠精子質量比較 模型組、ICA低劑量、ICA高劑量組精子密度、活率和活力均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ICA低劑量組大鼠精子密度和活力與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ICA高劑量組活率和活力均顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），精子密度與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠精子質量比較（±s）

表1 各組大鼠精子質量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組ICA低劑量組ICA高劑量組活力（%）38.22±5.66 16.04±4.16a 18.40±7.74a 26.65±5.52ab密度（×106mL-1）38.53±3.77 12.98±4.16a 14.71±6.10a 14.64±6.65a活率（%）53.57±5.83 22.74±6.11a 27.32±6.63a 38.73±7.37ab

2.2 各組大鼠TNBP含量比較 模型組和ICA低劑量組、ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著高于對照組，RP值顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ICA高劑量組TH、TH/RP值均顯著低于模型組，RP值顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠TNBP含量比較（x±s）

3 討 論

目前，男性不育患者發(fā)病率呈上升趨勢，近20年來，人類精子數(shù)量平均每年以2%的速度下降。不育不僅影響患者的身心健康，而且還會帶來一些社會問題，因此，男性不育癥的研究已經(jīng)引起全世界的高度重視。

腺嘌呤可損傷睪丸組織、曲精小管，并導致生精細胞和TNBP數(shù)量減少、變性，常用于構建睪丸損傷大鼠模型[3]。本實驗發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤大鼠模型無論是精子密度、活力、活率和TNBP均顯著低于對照組，說明模型建立比較成功。

TNBP又稱魚精蛋白，是在晚期精子細胞中出現(xiàn)的一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白質。根據(jù)氨基酸的組成序列可分為兩類，一類是P1TNBP，存在于所有哺乳動物精子細胞中；另一類為P2TNBP，只存在于人類及很少一部分哺乳動物中。TNBP主要功能是濃縮精子細胞核，保護DNA的遺傳信息。

近年研究發(fā)現(xiàn)，精子細胞內組蛋白-精核蛋白反應（HPRR）和TNBP的數(shù)量與生育能力有密切關系[4-5]。哺乳動物精子從精原細胞發(fā)育為成熟精子的過程中，精子細胞內與DNA結合體細胞類型組蛋白，逐漸被TNBP取代，這個過程稱HPRR，通過HPRR，最終成為高濃度的精子特異性染色質。成熟精子內的堿性核蛋白主要為TNBP[6]。WU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鈣調素依賴蛋白激酶4（Camk4）的信使作用與TNBP的轉化有關。1976年，SILVESTRONI等[8]首次報道15例少精子癥不育患者的成熟精子缺乏TNBP成分，認為這是導致原發(fā)性不育癥的原因之一。CARRELL等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，P2精核蛋白異常與生育力減退有關。DE YEBRA等[10]報道，116例男性少弱精癥患者TNBP異常率為77.5%，且有些患者P2 TNBP完全缺失。陳暉等[11]對1 050例少弱精癥患者TNBP分析提示，異常率為81.05%，認為男性TNBP指標可供臨床評價精子受孕能力。費江楓等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤誘導的不育大鼠精子中TNBP及其mRNA含量明顯低于正常組。

ICA為淫羊藿的干燥莖葉提取物，是淫羊藿的主要有效成分之一。研究表明，ICA在心腦血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和腫瘤中具有重要的藥理作用。李波等[13]發(fā)現(xiàn)，ICA可使動物睪酮水平升高，并調控下丘腦CHR和垂體POMC基因的表達水平，說明ICA對生殖系統(tǒng)的影響主要在下丘腦和垂體組織。高學勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能促進幼年小鼠附睪及精囊的發(fā)育。覃光輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ICA能明顯改善雷公藤多苷對小鼠睪丸的病理損傷，與模型組相比，治療組小鼠睪丸生精管管壁較厚，細胞層次較寬，細胞增殖旺盛。高孟婷等[16]應用125I放射免疫法測定不同濃度ICA對家兔陰莖海綿體內PDE5酶底物cGMP水平的影響。結果顯示，ICA能提高陰莖海綿體內cGMP水平。蔣兆健等[17]也采用125I放射免疫法觀察ICA對家兔陰莖海綿體平滑肌組織中cGMP水平的影響，結果顯示，ICA能直接升高cGMP水平。鐘瑜等[18]制備腎陽虛細胞模型，觀察ICA干預后糖皮質激素受體（GR）的mRNA和蛋白的表達情況。結果顯示，經(jīng)ICA干預后的GR mRNA和蛋白表達均明顯增加。表明ICA對內分泌系統(tǒng)的作用明顯。另外，ICA對性腺還有較大的影響作用。趙翌等[19]通過在獲能液mTBM+肝素中添加ICA，利用金霉素熒光染色法結合體外受精試驗，觀察新鮮豬精子的體外獲能效果，結果表明，ICA能夠顯著促進豬精子體外獲能效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，ICA高劑量組能顯著提高模型大鼠的精子活率、活力、RP值，說明ICA可促進精子獲能、提高TNBP含量；但是本研究也發(fā)現(xiàn)，ICA不能提高精子密度，而且ICA高劑量組雖然可以有效改善大鼠精子的活率、活力和TNBP含量，但仍然低于對照組。分析原因可能與用藥時間短和樣本量少有關，下一步擬擴大樣本量、進一步延長用藥時間進行研究。

綜上所述，ICA作為一種傳統(tǒng)中藥，可通過提高RP值和精子活率來有效改善雄性生殖功能。

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