華蟾素通過激活caspase3誘導HeLa細胞凋亡

趙 昕，姜 義，趙 穎，黃 銳

(1.吉林大學第一醫院 體檢中心，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院 a.乳腺外科；b.手足外科；c.神經外科)

宮頸癌是一種常見的，嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，目前宮頸癌已超過乳腺癌居女性惡性腫瘤第一位[1]。華蟾素是從中華大蟾蜍干皮中提取得到的有效成分，主要含有吲哚生物堿、多肽、蟾蜍內脂及色素等[2,3]。實驗研究和臨床試驗結果均證明其有抗腫瘤作用，而目前國內外關于華蟾素對宮頸癌的作用機制尚不清楚[4-6]。本研究通過觀察華蟾素對HeLa細胞生長增殖的影響，從誘導細胞凋亡方向探討華蟾素抑制HeLa生長增殖作用的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株養

宮頸癌細胞株HeLa購于上海歌凡生物科技有限公司，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液，在含5% CO2的37 ℃培養箱中培養。

1.2 藥品與試劑

華蟾素注射液購于安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，小牛血清購于賽澳美細胞技術(北京)有限公司，RPMI1640培養液購于GIBCO， Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司，caspase-3抗體購于Cell Signaling Technology，β-actin購于天津津脈，BCA試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒購于碧云天生物科技研究所，MTT購于Sigma。

1.3 MTT檢測

取對數生長的HeLa細胞，調整細胞濃度至4×104/ml，加入96孔板，每孔200 μl。分別設對照組和藥物組(2.5，5.0，10，20和40 μg/ml)，每個濃度設5個復孔。將細胞放置于二氧化碳培養箱中繼續培養20，44和68 h，然后分別每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續培養4 h，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO溶解甲臜，震蕩10 min，在570 nm波長處檢測吸光度，依據下面公式計算生長抑制率。

生長抑制率(%)=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 AO/EB 染色

取對數生長的HeLa細胞，調整細胞濃度加入6孔板，待細胞生長過夜后，加入不同濃度的華蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌細胞兩次，然后用100 μl PBS重懸細胞，在細胞懸液中加如25 μl AO/EB混合液，混合均勻， 滴加至載玻片上，加蓋玻片后立即在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 Annexin V-FITC 雙染

取對數生長的HeLa細胞，調整細胞濃度加入6孔板，24 h后，加入不同濃度的華蟾素(2.5,5和10 μg/ml)作用24 h，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，加入500 μl Binding Buffer重懸細胞，然后加入Annexin V 5 μl，混勻后再加入PI 5 μl ，室溫、避光反應15 min，最后用流式細胞儀分析，激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。

1.6 Western blot檢測Caspase-3蛋白表達

取對數生長的HeLa細胞，調整細胞濃度加入6孔板，待細胞生長過夜后，加入不同濃度的華蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，加入 RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4 ℃13 000 g 離心5 min，收集上清液。采用BCA方法測定上清液中蛋白濃度，取等量的總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜、封閉、加入caspase-3抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，ECL顯影，β-actin作為內部參照。

1.7 Caspase-3活性檢測

取對數生長的HeLa細胞接種于6孔板，待細胞生長過夜后，加入不同濃度的華蟾素2.5,5和10 μg/ml作用24 h，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，加入裂解液(2×106個細胞/100 μl)重懸細胞，冰浴裂解15 min，15 000 g 離心10 min，收集上清液。按照說明書要求操作， 405 nm檢測吸光度，計算Caspase-3活力。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 華蟾素抑制HeLa細胞增殖

如圖1所示，華蟾素在10 μg/ml時，可以明顯抑制HeLa細胞生長，且生存率隨著藥物劑量的增加而減小，呈量效關系，24 h的IC50為12.02 μg/ml (圖1)。說明華蟾素可以抑制HeLa細胞的增殖，但機制有待進一步研究。

圖1 華蟾素對HeLa細胞生長增殖的影響

2.2 華蟾素誘導HeLa細胞凋亡的形態學

上面的結果提示華蟾素可以抑制HeLa細胞增殖，但具體機制尚不明確，因此我們應用AO/EB法檢測華蟾素是否能夠誘導HeLa細胞凋亡。如圖2所示，對照組細胞的細胞核呈均一亮綠色熒光，藥物處理組細胞的細胞核呈橘紅色，固縮狀，且隨著華蟾素劑量的增加，呈橘紅色熒光的細胞不斷增加，提示華蟾素可以誘導HeLa細胞凋亡(圖2)。

圖2 華蟾素對HeLa細胞 凋亡形態學的影響

2.3 華蟾素對HeLa細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC染色是目前公認的靈敏，高效的凋亡細胞檢測方法。因此我們采用Annexin V-FITC染色檢測華蟾素對HeLa細胞凋亡率的影響。結果發現，對照組及華蟾素2.5,5和10 μg/ml作用于HeLa細胞24 h后，可明顯誘導細胞凋亡，凋亡率分別為3.8%，8.1%，19.2%和30.9%(圖3)。

2.4 華蟾素激活caspse-3

Caspase蛋白家族在調節細胞凋亡過程中發揮著十分關鍵的作用，其中caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。我們首先用Western blot檢測華蟾素對caspase-3蛋白的影響。結果顯示，隨著華蟾素劑量的增加，caspase 3逐漸被剪切活化(圖4)。接下來我們采用分光光度法檢測caspase-3活性的變化。結果顯示，隨著華蟾素劑量的增加，caspase-3活性明顯升高，呈劑量依賴關系，結果圖5。

3 討論

目前，腫瘤是嚴重威脅人類健康的主要疾病，化學治療作為傳統的腫瘤治療手段仍是臨床治療腫瘤的主要方法之一。近年來，許多文獻報道了華蟾素在體內和體外具有抗腫瘤作用，其機制與誘導細胞凋亡有關[7,8]。但對人宮頸癌的作用報道較少，因此本研究以人宮頸癌細胞株HeLa細胞為對象，研究華蟾素對HeLa細胞生長增殖的作用，并探討其可能的作用機制。

我們通過體外實驗發現，華蟾素能夠抑制人宮頸癌細胞株HeLa生長，其抑制增殖效應呈現劑量依賴性。從1982年細胞凋亡概念提出以來一直是腫瘤研究方面的熱點，因此我們以此為方向通過形態學方法檢測華蟾素是否能誘導HeLa細胞凋亡。細胞凋亡是一種非常復雜的生理和病理過程，有學者發現多種化療藥物無論藥物的靶點何在，它們最終都是通過誘導腫瘤細胞凋亡而達到治療目的的[9]。實驗結果顯示，華蟾素可以誘導HeLa細胞凋亡(圖2，圖3)。

細胞凋亡受到各種凋亡調控蛋白的調控，Caspase蛋白酶家族是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶，是細胞凋亡調控的關鍵分子群,其中caspase-3 是凋亡執行的重要效應分子，無論是外源性途徑還是內源性途徑都通過激活caspase-3，降解底物使細胞凋亡[10]。我們研究發現，華蟾素可以提高caspase-3活性，我們推測華蟾素可能是通過激活caspase-3 而進一步誘導HeLa細胞凋亡。

圖3 華蟾素對HeLa細胞凋亡率的影響

圖4 華蟾素對caspse-3蛋白表達的影響

圖5 華蟾素對caspse-3活性的影響

總之，華蟾素可以劑量依賴的抑制人宮頸癌細胞HeLa細胞的增殖，這種效應可能與其誘導HeLa細胞凋亡的發生有關，具體的作用機制需要進一步深入探討。

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