姜黃素調控自噬抑制K562細胞增殖的體外研究

于波海，于 鑫，王 鑫，滕 旭

(1.哈爾濱醫科大學 生物學博士后流動站，黑龍江 哈爾濱150081；2.哈爾濱市第一醫院 檢驗科，黑龍江 哈爾濱150010；3.大連大學附屬中山醫院 醫學檢驗部，遼寧 大連116001；4.銀川市興慶區掌政鎮中心衛生院，寧夏 銀川750001)

姜黃素 (Curcumin) 是從姜科姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種相對分子質量小的多酚類物質,通常認為它是姜黃中的最有效成分[1]。研究顯示，姜黃素可抑制肺癌、結腸癌、多發性骨髓瘤、腦膠質瘤等多種腫瘤細胞增殖[2]。姜黃素作為天然化合物，在抗腫瘤作用中具備多個靶向通路，同時能夠規避常規抗腫瘤藥物的抵抗性，因此姜黃素在抗腫瘤方面應用前景廣泛。自噬 (autophagy) 是細胞防御和應激調控的重要機制，在抗腫瘤、抵抗微生物、代謝平衡等方面發揮重要的生物學作用[3]。慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞是CML研究中重要的實驗模型，該細胞可產生BCR-ABL融合蛋白，可評估多種細胞或分子反應，如：細胞死亡模式(自噬或凋亡) 、腫瘤細胞分化以及BCR-ABL酪氨酸激酶降解等。本研究以K562細胞為研究對象，觀察姜黃素對K562細胞增殖以及自噬作用的影響，并探討可能的機制。

1 實驗材料與方法

1.1 細胞株

慢性粒細胞白血病急變細胞系K562購自和元生物技術(上海)股份有限公司。

1.2 主要試劑

RPMI 1640 培養基購自美國GIBCO公司；胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自以色列Biological Industries公司(Cat No.04-001-1A；Lot No.215356) ；青、鏈霉素抗菌液，購自美國GIBCO公司；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA) 購自Sigma-Aldrich公司；姜黃素購自Sigma-Aldrich公司；四唑氮藍(MTT) 購自Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠LC3 IgG購自日本MBL公司；鼠抗人β-actin IgG購自中杉金橋公司。

Western Blotting ECM增強顯色法檢測試劑盒(Cat No.EK1004) 購自武漢博士德生物工程有限公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Cat No.AR0138) 購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白質定量試劑盒(Cat No.5000002) 購自美國Bio-Rad公司。其它試劑均為國產分析純。

1.3 主要試劑配制

姜黃素用DMSO完全溶解，配制成100 mM儲存液，4℃保存備用。

1.4 主要儀器

酶標儀(美國 Bio-Rad 公司) ；MCO-17A1型二氧化碳培養箱(日本Sanyo公司) ；ClassII typeA2生物安全柜(北京東聯公司) ；垂直電泳槽、轉移電泳槽(美國 Bio-Rad 公司) ；FACS Calibur流式細胞儀(美國 BD公司)。

1.5 MTT檢測K562細胞增殖

實驗分為對照組和藥物處理組，取對數生長期K562，調整細胞濃度至1×105/ml，接種于96孔板中，經姜黃素與3-MA作用6,12,24 h后，培養終止前4 h棄培養上清，加入100 μl MTT (5 mg/ml) 溶液，實驗終濃度分別為1.00，2.50，5.00，10.00，20.00 μM/L，每一濃度設3個平行孔，對照組加終濃度為0.04% DMSO， CO2孵箱內培養，離心(1 000 r/min,5 min),然后棄去孔內培養液，每孔加人100 μl DMSO，震蕩180秒后，用 酶標儀于570 nm波長處測定其吸光度A值，重復3次，按下列公式計算細胞抑制率 (Inhibition Rate,IR) :抑制率= (A對照組值-A實驗組值)/(A對照組值-A空白對照值)×100%。

1.6 細胞蛋白提取與Western blot分析

收集約3×106個K562細胞，加入預冷的裂解緩沖液 (含1% Triton X-100，1%脫氧膽酸和0.1% SDS) 冰上裂解30 min。蛋白濃度采用Bradford加以測定 (Bio-Rad，CA，USA) 。獲取50 μg蛋白在12%濃度的分離膠中進行SDS-PAGE，電泳結束后將其轉印至硝酸纖維素膜上，并用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，最后分別加入相應一抗以及二抗，化學發光、顯影 (Amersham Bioscience，NJ，USA) 。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數生長期K562細胞接種于6孔培養板中(5×105/孔)，對照組加入終體積分數為 0.04%的 DMSO及3-MA(2 μmol/L)，藥物處理組分別加入終濃度為20.00 μM/L的姜黃素和3-MA，培養48 h后收集細胞，用預冷的PBS 洗滌細胞一次，1 500 rpm，5 min離心收集，調整細胞濃度為 1×106/mL，取1 ml單細胞懸液。70%預冷乙醇 500 μl固定過夜，檢測前去除固定液，加入碘化丙啶(PI)，于 4 ℃避光處理30 min，上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 姜黃素抑制K562細胞增殖

姜黃素 1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μM濃度作用于K562 細胞12、24、48小時，結果顯示，姜黃素對K562細胞株的增殖存在明顯抑制作用 (P<0.05) ，且存在劑量依賴關系(圖1)。

圖1 不同濃度姜黃素在不同時間點對K562細胞增殖抑制作用

2.2 自噬抑制劑3-MA降低姜黃素對K562細胞的抑制作用

MTT結果顯示，應用20.00μM濃度的姜黃素作用K562細胞24 h后，其增殖作用受到明顯抑制；而單獨應用3-MA (2 μmol/L) 作用于K562細胞24 h，K562細胞增殖無明顯影響；與單獨使用姜黃素相比，姜黃素與3-MA聯合應用于K562細胞，其增殖的抑制作用明顯下降 (P<0.05) ，由此可見， 3-MA可以有效降低姜黃素對K562細胞的增殖抑制作用(圖2)。

圖2 姜黃素與自噬抑制劑3-MA對K562細胞增殖抑制作用

2.3 姜黃素增強LC3-II表達

Western blot結果顯示，應用20.00 μM濃度姜黃素作用K562細胞24 h后LC3-II表達增強，LC3-II/LC3-I比值增加；姜黃素與3-MA(2 μmol/L) 聯合應用于K562細胞，LC3-II表達減弱，LC3-II/LC3-I比值下降 (圖3)。

圖3 不同濃度姜黃素對K562細胞LC3- II / LC3- I表達的影響

2.4 姜黃素對K562細胞周期的影響

應用20.00 μM濃度姜黃素作用K562細胞48小時后，流式細胞儀檢測結果顯示，G1 期細胞增加,G2 期細胞數明顯減少，S期細胞也明顯減少，與對照組相比較差異顯著(P<0.05)。姜黃素與3-MA聯合應用于K562，與G1周期停滯比率明顯下降，S期細胞明顯增多，與姜黃素組相比較差異顯著(P<0.05) (圖4)。

圖4 姜黃素對K562細胞周期的影響

2.5 姜黃素誘導P53、P21、P27蛋白的表達

Western blot結果顯示，應用應用20.00 μM濃度姜黃素作用K562細胞24 h后，p53、p21及p27蛋白表達水平隨著姜黃素濃度的增加而增高，加入3-MA后，姜黃素對p53、p21及p27的誘導作用明顯減弱(圖5)。

3 討論

慢性粒細胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML) 是一類起源于多功能造血干細胞的惡性克隆性疾病。其診斷特征是9號染色體平衡易位至22號染色體，形成t (9;22) (q34;q11.2 )，即費城染色體(Philadelphia chromosome,Ph1)形成及BCR-ABL融合基因的產生[4]。盡管格列衛作為靶向藥物已經應用于臨床多年，但耐藥現象的發生嚴重干擾臨床治療效果并危及患者的生命，故繼續研究開發治療CML新藥物，探索新的治療策略一直受到國內外學者的關注。

圖5 姜黃素P53、P21、P27蛋白表達影響

細胞自噬是由基因調控高度保守的自行降解過程，在抵御外來刺激、自我凈化、內環境穩定、代謝平衡、抵抗微生物及治療腫瘤等方面發揮重要的生物學作用。研究表明，姜黃素作用于人類結腸癌 HCT116細胞，誘導ROS產生，促進LC3I向LC3II轉化，激活細胞自噬[5]。四氫姜黃素(Tetrahydrocurcumin) 是姜黃素主要的代謝產物，作用于人類白血病 HL-60 細胞，通過下調PI3K/AKT-mTOR及MAPK信號通路，誘導自噬[6]。

實驗中將姜黃素與K562細胞株孵育，通過MTT實驗檢測細胞增殖。結果顯示，姜黃素能夠抑制K562細胞增殖，并存在劑量、時間依賴關系。我們進一步研究了姜黃素是否通過自噬途徑影響K562細胞的增殖， 我們使用了3-甲基腺嘌呤(3-MA)，目前常用的一種自噬抑制劑，主要通過抑制哺乳動物細胞中的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)來抑制自噬的起始階段。與姜黃素單獨應用相比，姜黃素與3-MA聯合應用后，對K562細胞增殖抑制作用明顯下降，從而發現姜黃素抑制K562細胞增殖與自噬相關。

為了明確姜黃素作用K562細胞誘導自噬現象的發生，我們應用WB實驗檢測LC3表達水平。LC3是使用最廣的自噬標志物，定位于自噬泡上。自噬形成時，LC3- I (胞漿型LC3) 會酶解掉一小段多肽，轉變為LC3- II ( 膜型結合型LC3) 。LC3- II / LC3- I比值的大小可評估自噬水平的高低。結果顯示，姜黃素作用K562細胞顯著上調LC3- II / LC3- I比值，從而證實姜黃素誘導K562細胞自噬現象的發生。

K562細胞為高S期細胞，S期細胞增多提示DNA 復制活躍，處于增殖期的細胞增加，同時，從G1期向S期轉換的周期檢測點(check point)功能減弱，使發生突變的細胞可以不受周期檢測點的調控，直接進入S期復制，導致癌變的發生。姜黃素在調控K562細胞周期中發揮的一定的作用，細胞周期阻滯于G1期，進入S期的細胞大量減少，抑制細胞增殖，加強了機體內的DNA修復系統，增加DNA的修復，減低白細胞突變的發生率。而聯合應用3-MA后，G1周期停滯比例明顯減少，可見姜黃素誘導K562細胞周期停滯作用于自噬相關。

我們考慮到細胞程序性死亡包含細胞凋亡和自噬兩個過程，二者即聯系又區別[7]。自噬調控網絡非常復雜，P53作為自噬調節的關鍵分子，通過轉錄激活P21、生長抑制及DNA損傷誘導基因45alpha (Growth arrest and DNA damage-inducible gene45 alpha,Gadd45α) 及Bax等誘導細胞周期停滯、凋亡或自噬以及衰老抑制細胞增殖[8]。P53誘導自噬機制尚不明確，研究認為活化的 P53 會抑制自噬負調節子- 哺乳動物雷帕霉素靶點 (mammalian target of rapamycin,mTOR) ，形成自噬體以及 LC3的酯化和剪切引起自噬。P53可以通過轉錄依賴方式：AMP激活蛋白激酶活化抑制mTOR；和轉錄非依賴方式：上調mTOR抑制劑第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)及結節性硬化癥相關復合物1(Tuberous sclerosis complex 1,TSC1) 誘發自噬[9]。隨后檢測了p53、p21和p27的表達水平。結果顯示，姜黃素有效上調p53、p21和p27的表達，加入3-MA抑制自噬后，姜黃素對p53、p21和p27的上調效應減弱。以上結果證實，姜黃素抑制K562細胞增殖、誘導細胞周期停滯與自噬有關，這與國外研究結果一致。

綜上所述，本研究實驗證實了姜黃素誘導K562細胞發生自噬影響細胞增殖及細胞周期，增強p53、p21及P27自噬調節相關蛋白活性等一系列活動，從而發揮抑制腫瘤作用。在隨后的工作中，我們將對PI3K/AKT-mTOR信號通路及mTOR下游分子開展深入探討，以進一步明確自噬抑制K562細胞增殖的分子機制。

[1]Basnet P,Skalko-Basnet N.Curcumin:an anti-inflammatory molecule from a curry spice on the path to cancer treatment[J].Molecules,2011,16(6):4567.

[2]Shanmugam MK,Rane G,Kanchi MM,et al.The multifaceted role of curcumin in cancer prevention and treatment[J].Molecules,2015,20(2):2728.

[3]Klionsky DJ,Schulman BA.Dynamic regulation of macroautophagy by distinctive,ubiquitin-like proteins[J].Nature Structural & Molecular Biology,2014,21(4):336.

[4]Kurzrock R,Faderl S,Talpaz M,et al.The biology of chronic myeloid leukemia[J].New England Journal of Medicine,1999,341(3):164.

[5]Lee YJ,Kim NY,Suh YA,et al.Involvement of ROS in Curcumin-induced Autophagic Cell Death[J].Korean Journal of Physiology & Pharmacology Official Journal of the Korean Physiological Society & the Korean Society of Pharmacology,2011,15(1):1.

[6]Wu JC,Lai CS,Badmaev V,et al.Tetrahydrocurcumin,a major metabolite of curcumin,induced autophagic cell death through coordinative modulation of PI3K/Akt-mTOR and MAPK signaling pathways in human leukemia HL-60 cells[J].Molecular Nutrition & Food Research,2011,55(11):1646.

[7]Sharma G,Rana NK,Singh P,et al.p53 dependent apoptosis and cell cycle delay induced by heteroleptic complexes in human cervical cancer cells[J].Biomed Pharmacother,2017,88:218.

[8]Zhang W,Liu N,Wang X,et al.Benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide induced p53-independent necrosis via the mitochondria-associated pathway involving Bax and Bak activation[J].Human & Experimental Toxicology,2015,34(2):179.

[9]慈雅麗,許彩民.P53在自噬調節中的雙重作用[J].基礎醫學與臨床,2013,33(10):1328.