二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇誘導人乳腺癌細胞MCF—7凋亡的作用機制研究

梁君偉 方志華 李青山 呂喜英

[摘要] 目的 探討二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡的作用機制。 方法 以CCK-8試劑盒檢測不同濃度二甲雙胍（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）、紫杉醇（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 μmol/L）單獨作用或聯(lián)合作用MCF-7細胞48 h后對細胞增殖的半抑制濃度（IC50）值;以流式細胞儀檢測二甲雙胍、紫杉醇作用MCF-7細胞48 h后的細胞周期分布;以Western blot法檢測紫杉醇、二甲雙胍單獨作用或聯(lián)合作用MCF-7細胞48 h后MAPK通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白的表達。 結果 較低濃度的二甲雙胍（0.25～4.00 mmol/L）與紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）聯(lián)合作用具協(xié)同效果（CI<1）;sp600125可顯著抑制MCF-7細胞增殖，聯(lián)合二甲雙胍與紫杉醇對MCF-7細胞增殖的抑制作用明顯強于二者單獨作用;二甲雙胍與紫杉醇聯(lián)合時G2/M期細胞少于紫杉醇單藥應用，多于二甲雙胍單藥應用;二甲雙胍與紫杉醇聯(lián)合作用MCF-7細胞48 h后p-JNK/SAPK、p-p38蛋白表達明顯高于二者單用，p-ERK、Bcl-2蛋白表達降低（P < 0.05）。 結論 二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇作用人乳腺癌細胞MCF-7具協(xié)同效果，其與sp600125聯(lián)合時對細胞的抑制作用顯著增強。二甲雙胍與紫杉醇聯(lián)合作用還可抑制細胞在G2/M期聚集及ERK通路，激活JNK、p38通路，降低Bcl-2與Bax蛋白比例。

[關鍵詞] 二甲雙胍;紫杉醇;乳腺癌;MCF-7細胞;MAPK通路

[中圖分類號] R655.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（b）-0017-06

[Abstract] Objective To explore the role mechanism of Metformin combined with Paclitaxel in inducing apoptosis of human breast cancer cell MCF-7. Methods CCK-8 kit was used to detect the 50% inhibitory concentration （IC50 value） of cell proliferation after 48 h of single action of different concentrations of Metformin （0.25， 0.50， 1.00， 2.00， 4.00 mmol/L） or Paclitaxel （0.025， 0.050， 0.100， 0.200， 0.400 μmol/L） or two combined action on MCF-7 cell. And the flow cytometry was used to detect the cell cycle distribution after 48 h action of Metformin or Paclitaxel on MCF-7 cell. And Western blot method was used to detect the expression levels of MAPK pathway protein and Bcl-2， Bax proteins after 48 h of single action of Paclitaxel or Metformin or two combined action on MCF-7 cell. Results Low concentration of Metformin （0.25-4.00 mmol/L） combined with Paclitaxel （0.025-0.400 μmol/L） had a synergistic effect （CI<1）. sp600125 could significantly inhibite MCF-7 cell proliferation， and the inhibitory effect of MCF-7 cell proliferation by Metformin combined with Paclitaxel was stronger than that by single action of the two. The number of G2/M phase cells by combined action of Metformin and Paclitaxel were less than by single action of Paclitaxel， but more than by single action of Metformin. The expression levels of p-JNK/SAPK and p-p38 proteins after 48 h of Metformin combined with Paclitaxel on MCF-7 cell were significantly higher than those by single action of the two， and the expression levels of p-ERK and Bcl-2 proteins were decreased （P < 0.05）. Conclusion Metformin combined with Paclitaxel has a synergistic effect on human breast cancer cell MCF-7， and its inhibitory effect on cells is significantly enhanced when combined with sp600125. Metformin combined with Paclitaxel can inhibit cell aggregation and ERK pathway in G2/M phase， activate JNK and p38 pathway， and reduce the ratio of Bcl-2 and Bax proteins.

[Key words] Metformin; Paclitaxel; Breast cancer; MCF-7 cell; MAPK pathway

乳腺癌系全球婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤，每年有130萬名以上女性被診斷出患有乳腺癌，且患病人數(shù)持續(xù)增加，不僅嚴重威脅女性健康和生活質(zhì)量，還給全球衛(wèi)生系統(tǒng)帶來沉重負擔[1-2]?；熓悄壳爸委熑橄侔┑闹匾侄?，可有效降低患者體內(nèi)的瘤細胞載量。紫杉醇類化合物是當前國際公認的新型抗腫瘤藥物，可阻滯腫瘤細胞有絲分裂，誘導細胞凋亡，被證實對乳腺癌有確切療效[3]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的胰島素增敏劑，臨床應用廣泛。周寒麗等、鄭亞等[4-5]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還具有降低腫瘤發(fā)病風險、抑制腫瘤生長的作用，聯(lián)合應用二甲雙胍和化療藥物可有效抑制各種表型的乳腺癌細胞增殖，且比單用化療藥物效果更加明顯。本研究通過分析二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對人乳腺癌細胞MCF-7增殖凋亡的影響，探討藥物作用過程中與MAPK通路、Bcl-2基因家族之間的關系，進一步探討二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

MCF-7細胞（中國科學院上海細胞庫）、二甲雙胍片（上海北杰集團關東藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：20 141013，0.25 g，10粒）、紫杉醇注射液（海口市制藥廠有限公司，生產(chǎn)批號：20130127，30 mg，5支）、DTC-3G plus型PCR儀（西安天隆科技有限公司）、BD Biosciences FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）、1040×740× 2050超凈工作臺（深圳凈藍公司）、M301624 CO2培養(yǎng)箱[西化儀（北京）公司]、SZKT2040電泳裝置（武漢免疫實驗室）、BTNTA2020D凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賓達英創(chuàng)科技公司）、CP62-JSM-6390LV電子顯微鏡（北京中西遠大科技公司）、JA12002精密天平（北京易斯高科電子技術有限公司）、胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）、CCK8試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號：20131025）、ERK通道阻斷劑U0126、MAPK通路蛋白一抗（美國Cell Signaling公司）、JNK通路阻斷劑sp600125（美國Cayman公司）、Bcl-2、Bax一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞常規(guī)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS），置于37℃含5%CO2飽和濕度條件下的溫箱孵育，待細胞生長至對數(shù)期時加藥。

1.2.2 CCK8檢測 使用0.25%胰酶消化對數(shù)期MCF-7細胞后分別接種到96孔板（按照1×104個/孔），培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度（0、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00 μmol/L）的二甲雙胍或紫杉醇分別作用細胞，分別設3個復孔及3個對照孔，培養(yǎng)48 h后棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振搖10 min溶解完全后，使用酶聯(lián)免疫酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度值（OD值），計算二甲雙胍、紫杉醇對MCF-7細胞增殖的半抑制濃度（IC50值）。單藥實驗：在MCF-7細胞中分別以相應濃度比加入二甲雙胍（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）、紫杉醇（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 μmol/L）。聯(lián)合用藥實驗：分別以相應的濃度比在MCF-7細胞中加入二甲雙胍、紫杉醇。根據(jù)中效原理及CombiDrug統(tǒng)計軟件，繪制劑量-效應曲線及不同效應下合用指數(shù)曲線（Fa-CI曲線），定量分析兩者間的協(xié)同、拮抗或相加關系（合用指數(shù)CI<1為協(xié)同作用，CI=1為相加作用，CI>1為拮抗作用）。DMSO充分溶解10 mmmol/L U0126及1 mmol/L sp600125后，配制成20 μmol/L的終濃度作用，DMSO濃度<0.2%，并按照此方法檢測MCF-7細胞增殖。

1.2.3 細胞周期測定 分為對照組、紫杉醇組（TXT 0.05 μmol/L）、二甲雙胍組（MET 0.5 mmol/L）及聯(lián)合組（0.05 μmol/L TXT+0.5 mmol/L MET），MCF-7細胞生長至對數(shù)期加藥，48 h后獲得1×104個細胞，加1 mL生理鹽水離心5 min（轉速1200 r/min，離心半徑15 cm），重復3次;加100 μL 0.9%的氯化鈉溶液混合均勻后，再加入1 mL 75%酒精混勻;加入約50 μL碘化丙啶至終濃度達到65 μg/mL，4℃溫度下孵育30 min，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4 Western blot分析 細胞分組方式同細胞周期測定，收集處理48 h后的細胞，PBS液沖洗3次，加入250～500 μL預冷至0℃裂解液，置于低溫4℃冰箱中30 min，細胞裂解后轉移至EP管，4℃下離心5 min（轉速1200 r/min，離心半徑15 cm），取上清液于新的EP管，-20℃保存。使用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，加入1×SDS上樣緩沖液，混勻后100℃條件下煮沸5 min，使其充分變性，冷卻后分裝，低溫-20℃保存。每泳道加入100 μg蛋白，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)80 V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍指示劑跑完濃縮膠層后，100 V穩(wěn)壓電泳至彩虹Marker 28 kD遷移至分離膠下緣，電泳結束（約150 min）。切取目的膠塊，100 V穩(wěn)壓電將電泳產(chǎn)物轉移至硝酸纖維膜，經(jīng)5% BSA封閉液封閉2 h，加入MAPK通路蛋白一抗（1∶1000）、Bcl-2及Bax一抗（1∶500），4℃溫度下孵育過夜。孵育后的膜使用TBST緩沖液沖洗3次（5 min/次），辣根過氧化物酶標記二抗，置于37℃下作用1.5 h，將其作1∶2000稀釋。然后使用TBST緩沖液沖洗3次（5 min/次），ECL化學發(fā)光法顯色5 min，壓片保存。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 單藥及聯(lián)合用藥IC50值比較

二甲雙胍與紫杉醇聯(lián)合作用于細胞48 h后，細胞抑制率顯著強于二者單藥作用，見表1。較低濃度的二甲雙胍（0.25～4.00 mmol/L）與紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）聯(lián)合作用具協(xié)同效果（CI<1），隨藥物濃度增加，趨于相加或拮抗作用（CI≥1），見圖1。

2.2 對MCF-7細胞增殖的抑制作用

sp600125可顯著抑制MCF-7細胞增殖，聯(lián)合二甲雙胍與紫杉醇對MCF-7細胞增殖的抑制作用明顯強于二甲雙胍、紫杉醇單藥應用;U0126抑制MCF-7細胞增殖的作用不顯著（P > 0.05），與sp600125聯(lián)用，可拮抗sp600125抑制MCF-7細胞增殖的作用。同時阻斷MEK1/2、JNK兩條通路，二甲雙胍與紫杉醇抑制MCF-7細胞增殖的作用并無顯著增強（P > 0.05）。見圖2。

2.3 對MCF-7細胞周期的影響

紫杉醇可使MCF-7細胞阻滯在G2/M期，二甲雙胍阻滯在G1期，二者聯(lián)合用藥阻滯在G1期，但G1期細胞少于對照組，G2/M期細胞多于對照組。二甲雙胍與紫杉醇聯(lián)合的協(xié)同作用并無細胞周期協(xié)同效果，且G2/M期細胞少于紫杉醇單藥應用，多于二甲雙胍單藥應用。見表2、圖3。

2.4 對MCF-7細胞MAPK蛋白及凋亡蛋白作用

單藥作用及聯(lián)合作用MCF-7細胞48 h后收獲蛋白，紫杉醇組及聯(lián)合組p-ERK1/2蛋白明顯低于對照組及二甲雙胍組，PINK/SAPK蛋白表達增加，MET組對MAPK通路蛋白的作用沒有紫杉醇組顯著。聯(lián)合組p-JNK/SAPK、p-p38蛋白表達明顯高于紫杉醇組與二甲雙胍組，PERK1/2蛋白表達降低。作用MCF-7細胞48 h后，紫杉醇組、二甲雙胍組都可使凋亡蛋白Bcl-2表達降低，且聯(lián)合組效果更加顯著。但Bax蛋白并未發(fā)生顯著改變。見圖4～5、表3～4。

3討論

腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞的過度增殖和凋亡減少有關，而撕裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細胞信號傳遞的重要通路，哺乳動物實驗中已明確其成員ERK、p38、JNK、ERK5與乳腺癌發(fā)病密切相關[6]。其中ERK1/2信號傳導是細胞增殖的重要通道，p38和JNK信號可促進乳腺癌細胞凋亡及遷移。同時，細胞凋亡是受抑制細胞凋亡基因（Bcl-2等）和促細胞凋亡基因（Bax等）共同調(diào)控的復雜生理過程。在細胞內(nèi)，二者可結合成異質(zhì)二聚體而失活，而當二者相對表達量失衡時，則引起細胞凋亡進程改變。國內(nèi)外多項研究證實[7-9]，Bcl-2蛋白高表達不僅可直接影響乳腺癌患者預后，其基因家族還在多種腫瘤的形成過程及腫瘤化療藥物耐藥形成中起關鍵作用。

本研究通過體外二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇作用人乳腺癌細胞MCF-7，觀察MAPK通路及Bcl-2基因家族對細胞增殖的抑制作用，結果提示二者均可在體外抑制MCF-7細胞生長。紫杉醇是目前國際公認的新型抗腫瘤藥物，可促進微管蛋白聚合，使癌細胞停滯于G2/M期，阻滯腫瘤細胞有絲分裂、誘導細胞凋亡，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。Akyol等[10-12]多項研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇誘導MCF27細胞凋亡時Bcl-2表達水平顯著降低，且伴隨著Bcl-2磷酸化，Bcl-2不能與同源的Bax結合，使游離Bax表達水平顯著增高，促進細胞凋亡，同時bcl-2/Bax比率具明顯的時間及劑量依賴性。二甲雙胍是20世紀中葉用于治療2型糖尿病的胰島素增敏劑，近幾年對結直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和生殖系統(tǒng)腫瘤的細胞及動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制抗凋亡的Bcl-2基因表達，促進促凋亡的Bax基因表達，調(diào)控細胞凋亡平衡，抑制腫瘤生長，改善患者預后[13-15]。本研究顯示，較低濃度的二甲雙胍（0.25～4.00 mmol/L）與紫杉醇（0.025～0.400 μmol/L）聯(lián)合作用具協(xié)同效果。藥物濃度增加后，聯(lián)合組效果趨于拮抗作用，但細胞周期并不是單純的協(xié)同或拮抗作用，聯(lián)合組G2期細胞顯著少于紫杉醇組，可認為紫杉醇在細胞周期的阻斷作用中占主導低位，二甲雙胍可拮抗部分紫杉醇抗微管作用，因此聯(lián)合組G2期細胞介于紫杉醇組與二甲雙胍組之間。

本研究中sp600125可顯著抑制MCF-7細胞增殖，其聯(lián)合紫杉醇與二甲雙胍的抑制作用強于單藥作用，提示JNK通路對藥物發(fā)揮療效促進腫瘤細胞凋亡具重要作用。JNK通路活化可介導細胞凋亡，但一定條件下，也可起到提高細胞存活能力，促進腫瘤進展的作用。sp600125作為JNK通路阻斷劑，可抑制JNK下游蛋白磷酸化，降低腫瘤細胞活性，且具一定劑量依賴性[16-18]。本研究中JNK通路雖然被阻斷，但聯(lián)合組抑制作用并未有顯著增強，提示紫杉醇與二甲雙胍聯(lián)合JNK通路并未起到明顯的促進細胞存活作用。U0126可通過抑制細胞黏附作用及血管生長起到抑制腫瘤侵襲與轉移的作用，從而誘導腫瘤凋亡[19]。但本研究中此種抑制作用并不明顯，U0126與sp600125聯(lián)用反而會對sp600125的抑制作用起到拮抗效果。且阻斷ERK1/2及JNK通路后紫杉醇及二甲雙胍對MCF-7細胞的抑制作用并未強于二者單獨作用，究其原因可能是由于MAPK是一個獨立的復雜系統(tǒng)，交叉作用廣泛，難以確保以某個點或通路為靶向。

本研究聯(lián)合組p-ERK蛋白表達水平明顯低于紫杉醇組與二甲雙胍組，p-JNK及p-p38蛋白水平明顯高于紫杉醇組與二甲雙胍組，提示紫杉醇與二甲雙胍聯(lián)合可抑制ERK通路，激活JNK、p38通路，使下游蛋白表達變化，從而促進細胞凋亡，且細胞存活與凋亡均與ERK、JNK、p38通路間的動態(tài)平衡相關。紫杉醇與二甲雙胍聯(lián)合作用中，ERK、JNK、p38蛋白因藥物協(xié)同作用而發(fā)生適應性變化，MAPK通路蛋白表達水平的變化可能也與這種動態(tài)平衡相關。

腫瘤細胞中Bcl-2基因表達水平較高可促進腫瘤進展，Bcl-2基因表達降低或缺失可抑制腫瘤生長[20]。本研究聯(lián)合組作用MCF-7細胞后Bcl-2蛋白表達水平顯著低于紫杉醇組與二甲雙胍組，Bax蛋白表達水平略有提高，可認為Bcl-2與Bax基因間存在動態(tài)平衡，可調(diào)控腫瘤細胞的分裂與死亡。聯(lián)合組協(xié)同作用可降低Bcl-2與Bax蛋白比例，下調(diào)Bcl-2通路，從而增強紫杉醇對MCF-7細胞的敏感性，且與MCF-7細胞雌激素受體（ER）表達相關。因此，臨床治療過程中可通過調(diào)控Bcl-2家族表達，增強紫杉醇對ER（+）乳腺癌的化療敏感性，更好地改善乳腺癌患者預后。

綜上所述，體外低劑量二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇作用人乳腺癌細胞MCF-7具協(xié)同作用，可抑制細胞在G2/M期聚集及ERK通路，激活JNK、p38通路，降低Bcl-2與Bax蛋白比例，下調(diào)Bcl-2通路，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，抑制腫瘤生長。

[參考文獻]

[1] 陳萬青，鄭榮壽.中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J].中國腫瘤臨床，2015，42（13）：668-674.

[2] 石建偉，唐智柳，蔡美玉，等.2008～2012年我國女性乳腺癌流行狀況的系統(tǒng)性綜述[J].中國婦幼保健，2014，29（10）：1622-1626.

[3] 張龍，王鳳瑋.紫杉醇用于乳腺癌治療的應用進展[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（31）：167-168.

[4] 周寒麗，耿健雄，張華.二甲雙胍抗腫瘤機制的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2015，23（12）：1760-1763.

[5] 鄭亞，孫紅.二甲雙胍聯(lián)合化療藥對婦科腫瘤的作用[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2016，25（11）：856-858.

[6] 吳婧，王寧菊，馬吉光.MAPK蛋白在乳腺癌中的表達及其意義[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2014，36（7）：743-745.

[7] 郝磊，魏現(xiàn)娟，郝坤.p53及bcl-2蛋白在乳腺癌中表達的相關性研究[J].中國婦幼保健，2017，32（4）：695-697.

[8] Pusztai L，Krishnamurti S，Perez CJ，et al. Expression of BAG-1 and BcL-2 proteins before and after neoadjuvant chemotherapy of locally advanced breast cancer [J]. Cancer Invest，2015，22（2）：248-256.

[9] Noh KT，Cha GS，Kang TH，et al. Enhancement of paclitaxel-induced breast cancer cell death via the glycogen synthase kinase-3β-mediated B-cell lymphoma 2 regulation [J]. Bmb Rep，2016，49（1）：51-56.

[10] Akyol Z，？覶oker-Gürkan A，Arisan ED，et al. DENSpm overcame Bcl-2 mediated resistance against Paclitaxel treatment in MCF-7 breast cancer cells via activating polyamine catabolic machinery [J]. Biomed & Pharmacother，2016，84：2029-2041.

[11] 馬驥，余惠云，劉穎，等.二甲雙胍抗腫瘤效應的基礎與臨床研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（33）：6587-6589.

[12] Queiroz EAIF，Puukila S，Eichler R，et al. Metformin Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest Mediated by Oxidative Stress，AMPK and FOXO3a in MCF-7 Breast Cancer Cells [J]. PLoS One，2014，9（5）：e98207.

[13] 趙松，楊金剛，李長嶺，等.蛋白激酶A抑制劑H-89通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶1的磷酸化阻斷SP600125誘導的CMK細胞多倍體化[J].細胞與分子免疫學雜志，2016，32（10）：1321-1326.

[14] Choi JE，Su HK，Lee SJ，et al. Prognostic significance of Bcl-2 expression in non-basal triple-negative breast cancer patients treated with anthracycline-based chemotherapy [J]. Tumor Biol，2014，35（12）：12 255-12 263.

[15] Chen L，Bourguignon LYW. Hyaluronan-CD44 interaction promotes c-Jun signaling and miRNA21 expression leading to Bcl-2 expression and chemoresistance in breast cancer cells [J]. Mol Cancer，2014，13（1）：52.

[16] 王瓊，王佑民，毋飛飛，等.JNK通路在高糖促人乳腺癌MCF-7細胞增殖中的作用[J].安徽醫(yī)科大學學報，2014， 49（2）：149-154.

[17] Urrutia A，Rubio-Araiz A，Gutierrez-Lopez MD，et al. A study on the effect of JNK inhibitor，SP600125，on the disruption of blood-brain barrier induced by methamphetamine [J]. Neurobiol Dis，2013，50（1）：49.

[18] Jemaà M，Vitale I，Kepp O，et al. Selective killing of p53-deficient cancer cells by SP600125 [J]. Embo Mol Med，2012，4（6）：500.

[19] Si L，Zheng L，Xu L，et al. Dioscin suppresses human laryngeal cancer cells growth via induction of cell-cycle arrest and MAPK-mediated mitochondrial-derived apoptosis and inhibition of tumor invasion [J]. Eur J Pharmacol，2016，774（4）：105-117.

[20] 饒國洲，婁鳴，景娟，等.survivin和bcl-2雙基因敲減對人舌癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J].陜西醫(yī)學雜志，2017， 46（2）：145-147.

（收稿日期：2018-07-16 本文編輯：任 念）