柑橘素預處理對大鼠缺血/再灌注心臟損傷后能量代謝的影響

[摘要] 目的 探討柑橘素預處理對大鼠缺血/再灌注心臟損傷后能量代謝的影響。 方法 將50只雄性成年Sprague-Dawlay大鼠按照隨機數字表法分為五組（n = 10）：空白對照組、模型組和柑橘素低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L）。各組大鼠心臟分別給予30 min全心缺血，然后給予120 min再灌注;柑橘素低、中、高劑量組大鼠分別在缺血前給予5、10、20 μmol/L柑橘素預處理;灌注結束后測定各組大鼠心肌乳酸脫氫酶含量、心肌梗死面積，測定心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力。 結果 缺血再灌注損傷后，與模型組比較，柑橘素低、中、高劑量組乳酸脫氫酶含量下降（P < 0.05或P < 0.01），心肌梗死面積減小（P < 0.05或P < 0.01），心肌組織Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力升高（P < 0.05）。 結論 柑橘素可能通過增強缺血/再灌注大鼠心肌的能量代謝，發揮心臟保護作用。

[關鍵詞] 柑橘素;缺血/再灌注;能量代謝;大鼠

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（b）-0022-04

ischemia/reperfusion in rats. Methods According to random number table method， 50 adult male Sprague-Dawley （SD） rats were divided into five groups （n = 10）： blank control group， modle group， and low， medium， high dose of naringenin group （5， 10， 20 μmol/L）. The heart of rat in each group was treated with 30 min global ischemia followed by 120 min reperfusion; the rats of low， medium， high dose of naringenin group were treated with 5， 10， 20 μmol/L of naringenin perfusion before ischemia; after reperfusion， the myocardial content of lactate dehydrogenates and myocardial infarct size in each group were examined， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were detected. Results After ischemia/reperfusion injury， compared with modle group， the contents of lactate dehydrogenates in low， medium， high dose of naringenin group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， the myocardial infarct size was significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were significantly improved （P < 0.05）. Conclusion Narigenin palys a cardioprotective role may be through enhancing the myocardial energy metabolism of rats with ischemia/reperfusion.

[Key words] Naringenin; Ischemia/reperfusion; Energy metabolism; Rats

柑橘素，屬二氫黃酮類，存在于葡萄柚、檸檬、番茄等薔薇科、蕓香科植物的果實或者果皮中[1]。柑橘素具有多種生物學活性，目前報道的有抑制腫瘤細胞增殖[2]、抑制炎癥水平[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、改善動脈粥樣硬化[6]等。近年來研究發現，柑橘素對大鼠的心肌損傷有保護作用[7]。本研究通過應用大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的模型，探討柑橘素保護大鼠心臟缺血/再灌注損傷的作用機制是否與能量代謝有關。

1 材料與方法

1.1 試劑

采用美國Sigma公司生產的柑橘素（生產批號：201 30503）。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，溶解柑橘素，配成柑橘素母液，所需柑橘素濃度由灌流液（即K-H液：NaCl 118.3 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，pH為7.35～7.4）稀釋所成。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（生產批號：20130103）、ATP酶試劑盒（生產批號：20140410）、考馬斯亮藍試劑盒（生產批號：20110210）均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重280～300 g，1月齡，正常大鼠生長環境喂養。河北醫科大學動物中心提供，合格證號：SCXK（冀）2014-1-003。所有動物實驗遵照《實驗動物關懷與使用指南（Publication revised 1996;National Institutes of Health，Bethesda，MD）》進行，所有實驗程序均由河北醫科大學動物使用委員會批準。將實驗動物按隨機數字表法分為五組：空白對照組、模型組和柑橘素低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L）。

1.3 缺血再灌注損傷模型制備

大鼠以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，迅速開胸后取出心臟。將心臟置于氧飽和的4℃ K-H液中，剪開心包，將主動脈接于Langendorff灌流裝置，以37℃氧飽和的K-H液進行恒壓恒溫逆向灌流（灌流壓力為80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）。大鼠心臟經K-H液灌流穩定30 min后，給予30 min全心缺血，然后給予120 min再灌注處理;造模成功標準為缺血再灌注后，心肌舒縮功能出現障礙，形態上出現心肌梗死。

1.4 動物分組與給藥

空白對照組大鼠只給予K-H液平衡灌流180 min;模型組大鼠給予K-H液平衡灌流30 min，缺血30 min，復灌120 min;柑橘素低、中、高劑量組大鼠心臟在缺血前分別給予5、10、20 μmol/L濃度的柑橘素液灌流10 min，再予缺血30 min，復灌120 min。

1.5 心臟流出液LDH含量測定

各組大鼠分別在復灌后60 min采集心臟冠脈流出液，應用比色法，利用分光光度計，按照LDH試劑盒說明書操作。

1.6 ATP酶活力測定

灌流結束后，取部分心肌組織，生理鹽水洗凈血跡，制成勻漿，離心，取上清。采用定磷法，應用分光光度計測定OD值，計算Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶含量，操作嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.7 心肌梗死面積（MIS）測定

灌流結束后，取下心臟，將心室切成均勻的5片。將其置于37℃的10% TTC溶液中避光孵育15 min，甲醛固定2 h。以數碼相機采集圖像，運用ImageProPlus 7.0軟件圖像分析系統進行分析。梗死區域呈蒼白色，MIS為梗死區占心室總面積的百分比。

1.8 統計學方法

應用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 柑橘素對冠脈流出液LDH的影響

缺血/再灌注60 min時，空白對照組冠脈流出液中的LDH明顯低于模型組（P < 0.01），柑橘素低、中、高劑量組冠脈流出液中LDH含量均顯著低于模型組（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 柑橘素預處理對MIS的影響

缺血再灌注120 min后，柑橘素低、中、高劑量組MIS均明顯低于模型組（P < 0.05或P < 0.01），且柑橘素中、高劑量組MIS明顯低于柑橘素低劑量組（P < 0.05）。空白對照組未出現心肌梗死，不納入統計范圍。見表1。

2.3 柑橘素預處理對ATP酶活力的影響

缺血/再灌注后，模型組大鼠心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力均較空白對照組顯著降低（P < 0.01）;柑橘素預處理可不同程度地影響ATP酶活力，與模型組比較，柑橘素低、中、高劑量組可升高Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

Jennings等[8]發現犬的心臟嚴重缺血后恢復再灌注會加重心肌壞死的程度。這種心肌細胞因缺血而發生可逆性的損傷，恢復血供后會使損傷加重，引起細胞死亡或進一步的功能障礙，稱之為缺血/再灌注損傷[9]。再灌注損傷后可引起心律失常[10]、心肌結構改變[11]、心肌壞死，以及血流動力學改變[12]。而MIS直接影響心功能的恢復及預后[13]。藥物預處理在心肌缺血前發揮作用，可以起到對抗心肌缺血/再灌注損傷的作用[14]。Subburaman等[15]研究發現，化療所致的心肌損傷大鼠模型中，柑橘素對心臟起保護作用。另有國外研究表明，在心腎綜合征大鼠模型中，柑橘素可以改善心室重構和心功能，抑制氧化應激[16]。本研究發現，柑橘素預處理可以縮小大鼠缺血/再灌注損傷后的MIS，提示柑橘素預處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用，可以改善心室功能。

缺血/再灌注損傷后，心肌細胞膜通透性增強，大量細胞內酶包括LDH、肌酸激酶（CK）、谷草轉氨酶（AST）彌散至細胞外，這些酶的增高代表心肌損傷的加重[17]。本研究通過測定缺血/再灌注后大鼠心肌組織中LDH活性，來檢測心肌細胞的損傷程度，結果顯示，柑橘素組冠脈流出液中的LDH含量較模型組降低。提示柑橘素可以穩定心肌細胞膜，保護受損傷的心肌。

缺血/再灌注損傷過程中，可發生氧自由基損傷、鈣離子超載、能量代謝障礙、炎癥介質釋放等[18]。研究認為，心肌缺血/再灌注損傷的起始環節是能量代謝障礙[19-21]。心肌組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶存在于細胞膜上，是維持心肌細胞興奮傳導、穩定細胞內環境的物質基礎[22]。當心肌缺血發生時，能量代謝發生障礙，細胞內ATP減少，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性下降，從而導致細胞內Na+、Ca2+積聚，K+、Mg2+流失[23]，造成細胞內高鈣、低鉀血癥。細胞內鈣超載會加重線粒體損傷，破壞細胞膜結構，最終引起心肌細胞的能量缺乏，造成遲發性細胞死亡等[24-25]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性顯著下降。而柑橘素低、中、高劑量組可以明顯提高心肌組織中的Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性，并且具有劑量依賴性。提示柑橘素預處理可以通過調節大鼠心臟缺血/再灌注損傷后的離子失衡，維持細胞內環境穩態，促進能量代謝的恢復。

綜上所述，柑橘素對大鼠心臟缺血/再灌注損傷具有保護作用，其作用可能與減少MIS、提高ATP酶活性、改善能量代謝有關，具體機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Tsai SJ，Huang CS，Mong MC，et al. Anti-inflammatory and antifibrotic effects of naringenin in diabetic mice [J]. J Agric Food Chem，2012，60（1）：514-521.

[2] Lou C，Zhang F，Yang M，et al. Naringenin decreases invasiveness and metastasis by inhibiting TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition in pancreatic cancer cells [J]. PLoS One，2013，7（12）：e50956.

[3] Karuppagounder V，Arumugam S，Thandavarayan RA，et al. Naringenin ameliorates daunorubicin induced nephrotoxicity by mitigating AT1R ERK1/2-NFκB p65 mediated inflammation [J]. Int Immunopharmacol，2015，28（1）：154-159.

[4] Rahigude，A，Bhutada，P，Kaulaskar，S，et al. Participation of antioxidant and cholinergic system in protective effect of naringenin against type-2 diabetes-induced memory dysfunction in rats [J]. Neuroscience，2012，9（26）：62-72.

[5] Tsai SJ，Huang CS，Mong MC，et al. Anti-inflammatory and antifibrotic effects of naringenin in diabetic mice [J]. Agric Food Chem，2012，60（1）：514-521.

[6] Yoshida H，Watanabe W，Oomagari H，et al. Citrus flavonoid naringenin inhibits TLR2 expression in adipocytes [J]. Nutr Biochem，2013，24（7）：1276-1284.

[7] Ramprasath T，Senthamizharasi M，Vasudevan V，et al. Naringenin confers protection against oxidative stress through Upregulation of Nrf2 target genes in cardiomyoblastcells [J]. J Physiol Biochem，2014，70（2）：407-415.

[8] Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al. Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog [J]. Arch Pathol，1960，70：68-78.

[9] 孟利敏，吳紹華，席樹強，等.柑橘素預處理對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國醫藥導報，2017， 14（18）：20-24.

[10] Ghiasl R，Mohammad M，Majidina M，et al. The effects of mebudipine on myocardial arrhythmia induced by ischemia-reperfusion injury in isolated rat heart [J]. Cell Mol Biol（Noisyle-grand），2016，62（13）：15-20.

[11] Meng G，Wang J，Xiao Y，et al. GYY4137 protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by attenuating oxidative stress and apoptosis in rats [J]. J Biomed Res，2015，29（3）：203-213.

[12] 劉丹，金良友，馮曉靈，等.柚皮苷對心肌缺血- 再灌注損傷大鼠血流動力學的影響[J].重慶醫學，2018，47（6）：733-739.

[13] 胡珍，陳景瑞，魏靜，等.冠狀動脈結扎制備大鼠心肌梗死模型及評價實驗研究[J].天津中醫藥，2016，33（2）：90.

[14] 國科，劉達興，容松.心肌缺血再灌注損傷的發生機制及其防治策略[J].中國醫藥導報，2016，13（29）：37-40.

[15] Subburaman S，Ganesan K，Ramachandran M. Protective role of naringenin against doxorubicin-induced cardiotoxicity in a rat model：histopathology and mRNA expression profile studies [J]. J Environ Pathol Toxicol Oncol，2014， 33（4）：363-376.

[16] Liu Y，An BS，Gao A. Protective effects of naringenin in cardiorenal syndrome [J]. J Surg Res，2016，203（2）：416-423.

[17] Gürsul C，Ekinci Akdemir FN，Akkoyun T，et al. Protectice effect of Naringin on experimental hindlimb ischemia/reperfusion injury in rats [J]. J Enzyme Inhib Med Chem，2016，31（sup1）：56-61.

[18] Ibanez B，Fuster V，Jimenez-Borreguero J，et al. Lethal myocardial reperfusion injury：a necessary evil [J]. Int J Cardiol，2011，151（1）：3-11.

[19] 譚玉婷，魯衛星，趙俊男，等.龍牙楤木總皂苷對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞線粒體細胞色素C和膜電位的影響及其作用機制[J].西部中醫藥，2016，29（12）：9-12.

[20] 佟彤，劉紅旭，尚菊菊，等.參元丹對缺血再灌注心肌細胞內質網應激相關因子GRP78、CHOP表達的影響[J].世界中醫藥，2016，11（3）：407-409.

[21] Qin H，Walcott GP，Killingsworth CR，et al. Impact of myocardial ischemia and reperfusion on ventricular defibrillation patterns，energy requirements，and detection of recovery [J]. Circulation，2002，105（（21）：2537-2542.

[22] Wang HY，O'Doherty GA. Modulators of Na/K-ATPase：a patent review [J]. Expert Opin Ther Pat，2012，22（6）：587-605.

[23] Gadeberg HC，Bryant SM，James AF，et al. Altered Na/Ca exchange distribution in ventricular myocytes from failing hearts [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2016，310（2）：H262-H268.

[24] 姚期，余資江，孫寶飛，等.松樹皮提取物對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[J].中國實驗動物學報，2017，25（6）：632-636.

[25] 程永生，陳宇，李冬.鈣超載及其在心肌缺血/再灌注損傷中的作用機制研究現狀[J].中國醫學創新，2013，10（3）：150-151.

（收稿日期：2018-08-29 本文編輯：張瑜杰）