烏芪舒筋通絡片的質量控制研究

謝鍇標 陳震堯 吳美珠

[摘要]目的 研究烏芪舒筋通絡片質量控制的可行方法。方法 采用薄層色譜法鑒別處方中的細辛、桂枝、牛大力，并采用高效液相色譜法測定處方中續斷的川續斷皂苷Ⅵ含量。結果 細辛、桂枝、牛大力的薄層色譜法鑒別專屬性強，陰性無干擾；川續斷皂苷Ⅵ的含量在491.7～1966.8 ng（r=0.9996）范圍內呈良好線性關系，平均加樣回收率為101.25%（n=9），RSD為1.40%。結論 定性、定量方法操作簡單，重現性好，專屬性強，能夠有效地控制烏芪舒筋通絡片的質量，可為該制劑的檢驗標準提供科學的依據。

[關鍵詞]烏芪舒筋通絡片；高效液相色譜法；薄層色譜法；川續斷皂苷Ⅵ；質量控制

[中圖分類號] R927.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）12（c）-0038-04

[Abstract] Objective To study the feasible method for quality control of Wuqi Shujin Tongluo Tablets. Methods TLC was used to identify Asarum， Cinnamon Twig and Niu Dali in the prescription， and HPLC was used to determine the content of Dipsacus Aspergillus saponin Ⅵ in the prescription. Results The TLC method of Asarum， Cinnamon Twig cassia and Niu Dali had strong specificity and no negative interference. The content of Dipsacus saponin Ⅵ had a good linear relationship between 491.7 and 1966.8 ng （R=0.9996）. The average recovery of sample addition was 101.25% （n=9） and RSD was 1.40%. Conclusion The qualitative and quantitative methods are easily operated and with excellent specificity and reproducibility.They can effectively control the quality of Wuqi Shujin Tongluo Tablets， and provide scientific basis for the test standard of the preparation.

[Key words] Wuqi Shujin Tongluo Tablets； HPLC； TLC； Diathesis saponin Ⅵ； Quality control

烏芪舒筋通絡片是骨傷科的專科特色制劑，具有補肝腎、通絡止痛的作用[1]，治療坐骨神經痛，軟組織疼痛有較好療效。該產品是由多種中草藥如制川烏、續斷、細辛、牛大力、黃芪等制成的純中藥制劑，多種成分具有抗菌活性[2]。因其含有制川烏、制草烏，故常規檢驗中應增加烏頭堿限量檢測[3]。原標準為《廣東省食品藥品監督管理局醫療機構制劑注冊標準》，只有針對防已所含的漢防已堿成分的理化鑒別、續斷所含的龍膽堿成分的理化鑒別，專屬性不強，質量控制方法相對落后，生產風險相對較大[4-5]，為確保本制劑安全有效，現按《廣東省醫療機構制劑質量制訂的技術要求》，對該制劑的質量檢驗進行了系統研究，建立了用薄層色譜鑒別法鑒別方中細辛、桂枝、牛大力，用高效液相色譜法測定方中續斷的川續斷皂苷Ⅵ含量。

1儀器與試藥

1.1主要儀器

Agilent 1260-LC型液相色譜儀（美國Agilent公司），Sartorius CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司），ZF1-I型多功能紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司），KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），FA1004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2試藥

樣品：烏芪舒筋通絡片，規格：60片/瓶，由肇慶市中醫院提供（肇慶市中醫院制劑室生產），批號：15050401、15051101、15052401；對照藥材：細辛（中國藥品生物制藥檢定所，批號：121204-200803）、桂枝（中國藥品生物制藥檢定所，批號：121191-201304）、續斷（中國藥品生物制藥檢定所，批號：121103-200806）、牛大力（中國藥品生物制藥檢定所，批號：121209-0101）；對照藥品：川續斷皂苷Ⅵ，僅供測含量使用，產自中國藥品生物制藥檢定所，批號：111685-201304；試劑：HPLG級乙腈、AR級甲醇、AR級乙醚、GR級環己烷、AR級正丁醇、GR級三氯甲烷、石油醚等；硅膠G薄層板，規格100 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm（青島海洋化工廠、煙臺市工業化學研究所），水為純化水。

2方法

2.1鑒別方法

2.1.1細辛的薄層色譜鑒別 取烏芪舒筋通絡片30片，除去包衣層。用干凈的60 mm研缽研細后轉移到150 ml燒杯中，加甲醇60 ml，超聲預處理20 min。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘渣加20 ml水溶解，再加乙醚20 ml在磁力攪拌器上進行振搖提取，反復提取3次，將乙醚提取液混合后蒸干。殘渣干燥后加1 ml乙酸乙酯，該溶解液作為供試品溶液。取細辛對照品精確稱取1 g，加甲醇30 ml，提取方式同細辛樣品，制成對照品供試液。

薄層色譜法檢測方式參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對照品供試溶液各5 μl和4 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細管將樣品在同一硅膠G薄層板上進行點樣，展開劑為正已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（16∶3∶4）[6]，將點樣后的玻板放入展開缸內展開，取出薄層板后晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，于105℃下活化30 min至斑點顯色清晰。用薄層掃描儀對斑點進行掃描，結果顯示，供試樣品與對照品在色譜相應的位置上，斑點顏色相同（圖1）。

2.1.2桂枝的薄層色譜鑒別 取本品60片，除去包衣，研細，加乙醚60 ml，40 KHz條件下超聲1 h。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘渣加1 ml乙醇溶解，該溶解液作為供試品溶液。另準確稱取桂枝對照品0.5 g，加乙醇30 ml，采用水浴加熱回流方式處理30 min，冷卻后用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘渣加20 ml水溶解，再加乙醚 在磁力攪拌器上進行振搖提取，反復提取3次，將乙醚提取液混合后蒸干，后續步驟同細辛提取方式，制成對照品供試液。

桂枝的薄層色譜法檢測方式也參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對照品供試溶液5 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細管將樣品在同一硅膠G薄層板上進行點樣，以油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑[7]，將點樣后的薄層板放入展開缸內展開，取出薄層板后晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃條件下活化30 min至斑點顯色清晰。用薄層掃描儀對斑點進行掃描，結果顯示，供試樣品與對照品在色譜相應的位置上，斑點顏色相同（圖2）。

2.1.3牛大力的薄層色譜鑒別 取本品25片，除去包衣，研細，加濃氨溶液1.5 ml、乙酸乙酯50 ml，40 KHz條件下超聲1 h。用快速定性濾紙過濾，濾液真空干燥，殘渣加1 ml乙酸乙酯進行溶解，該溶解液作為供試品溶液。另準確稱取牛大力對照藥材2.0 g，再加0.5 ml濃氨水溶液和30 ml的乙酸乙酯，參照上述細辛提取方式制成對照品供試溶液。

牛大力的薄層色譜法檢測方式也參照《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品和對照品供試溶液6 μl，以硅膠G作固定相，用普通毛細管將樣品在同一硅膠G薄層板上進行點樣，環己烷-乙酸乙酯（20∶3）為展開劑[8]，將點樣后的薄層板放入展開缸內展開，取出薄層板后晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃條件下活化30 min至斑點顯色清晰。將薄層板至于365 nm的紫外燈下進行檢視，結果顯示，供試樣品與對照品在色譜相應的位置上，斑點顏色相同（圖3）。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 本實驗所采用的色譜條件設定：色譜柱采用AgilentZORBAX-SB-C18（9.4×250，5 μm）；流動相采用乙腈-水（28∶72）等度對樣品進行洗脫；柱溫設定為30℃；流速設定為1.0 ml/min；進樣體積為10 μl；理論塔板數以川續斷皂苷Ⅵ計算，數值高于3200，波長212 nm。

2.2.2對照品溶液制備 一定量的川續斷皂苷Ⅵ對照品，加入甲醇溶液制備成川續斷皂苷Ⅵ儲備液，濃度為2458.5 μg/ml.精確量取儲備液1 ml于25 ml容量瓶中，加入流動相溶液定容至刻度線，充分混合均勻后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得對照品供試液，每l ml含98.34 μg川續斷皂苷Ⅵ。

2.2.3供試品溶液的制備 取烏芪舒筋通絡片樣品30粒，除去包衣層。用干凈的60 mm研缽研細后，精確稱取2.0 g樣品于具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇，40 KHz條件下超聲15 min，冷卻后稱量，并用甲醇補至原重量。混均后，用0.45 μl的微孔濾膜進行過濾。精確量取25 ml濾液，真空干燥后，加25 ml超純水進行溶解，再加水飽和的正丁醇50 ml在磁力攪拌器上進行振搖提取，再加30 ml正丁醇反復提取3次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次（50 ml，50 ml），再用正丁醇飽和的水洗滌2次（50 ml，50 ml），取正丁醇液，干燥后加甲醇溶解并轉移至25 ml容量瓶中，定容至刻度線后，混合均勻，用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾，濾液備用。

2.2.4陰性對照樣品溶液的制備 續斷陰性樣品的制備根據處方比例和工藝進行處理，具體步驟參照“2.2.3供試品溶液的制備”。

2.2.5專屬性試驗 分別精確吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀進行峰面積的測量，具體的測量條件設定參照“2.2.1”（圖4）。提示供試樣品與對照樣品在同一位置上具有相同的吸收峰，且分離度>1.5，陰性對照無干擾。

2.2.6線性范圍考察 精密量取3.2項下的貯備液2 ml，分別用乙腈-水（28∶72）混合液稀釋成49.17、78.67、98.34、147.51、196.68 μg/ml的溶液，分別進樣10 μl，按3.1的色譜條件進行測量設定，以進樣量（ng）作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，進行回歸方程的計算，得到川續斷皂苷Ⅵ的回歸方程：y=18 812x-120 283，r=0.9996。提示川續斷皂苷Ⅵ在491.7～1966.8 ng內呈現出良好的線性關系。

2.2.7精密度試驗 準確稱取對照樣品10 μl，每2.5 h進樣一次，重復進樣6次。色譜條件參照“2.2.1“所示，結果顯示，續斷皂苷的RSD值為1.16%，提示設備的精密程度良好。

2.2.8重復性試驗 取批號為15050401的供試樣品6份，每份2 g。按照“2.2.3”的實驗方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”的色譜條件進行測量，結果顯示，6份供試樣品中川續斷皂苷Ⅵ的平均含量為614.1 μg/片，川續斷皂苷Ⅵ的RSD=0.86%，提示這種方法對測量樣品中川續斷皂苷Ⅵ的含量具有良好的重復性。

2.2.9穩定性試驗 準確稱取批號為15050401的同一供試品溶液，在不同時間梯度（0、2、4、6、8 h）測定川續斷皂苷Ⅵ峰面積，數據結果顯示川續斷皂苷Ⅵ的RSD=2.26%，這也就說明該檢測方式在8 h內測定有穩定的結果。

2.2.10回收率試驗 準確稱取批號為15050401的同一供試品1 g，共稱取9份。再準確量取對照品儲備液制備成濃度為2458.5 μg/ml的溶液，每3份分別加入該溶液0.5、1、1.5 ml，參照“3.3”方式制備供試品溶液，制備的溶液分別進樣10 μl，計算川續斷皂苷Ⅵ的回收率，結果顯示，其平均回收率為101.25%（RSD=1.40%）（表1）。

2.2.11樣品含量測定 準確稱取3種不同批號的烏芪舒筋通絡片，按“2.2.3”供試品溶液制備方法處理并測定，以外標法計算含量，結果見表2。

2.2.12含量限度的制定 根據上述3批樣品的含量測定結果，川續斷皂苷Ⅵ含量的平均值為2.50 mg/g，每片平均含量為0.625 mg，若允許其含量下浮的幅度≤20%，則含量限度可定為：烏芪舒筋通絡片每片含川續斷皂苷Ⅵ≥0.50 mg。因不同產地、不同采收時間的藥材其川續斷皂苷Ⅵ成分含量略有差異[9-10]。因此擬定本品每片含川續斷皂苷Ⅵ≥0.45 mg。

3討論

3.1流動相的選擇

根據中國藥典和文獻記載，筆者曾用流動相為乙腈-水（30∶70）[6，11-13]測定續斷中川續斷皂苷Ⅵ，結果分離效果不理想，在主峰的后面有一小峰，故將流動相稍作改動[14]。

3.2提取方法的選擇

據文獻報道，筆者用加熱回流法[15-16]提取30 min和超聲[17-18]15 min作比較，結果用HPLC測定出來的峰面積幾乎一致，超聲提取方法操作簡單，耗時短，是最佳的選擇。

3.3細辛、桂枝及牛大力薄層色譜鑒別的方法學驗證

首先進行點樣量的考察，以確定供試品取樣量，對照品溶液和供試品溶液的點樣量；耐用性試驗中考察了自制板、煙臺硅膠G板及青島硅膠G板3種不同的薄層板，以及不同溫度、濕度梯度對薄層色譜的影響[19-20]，實驗結果顯示，不同條件下斑點的Rf值存在差異，但色譜分離良好，斑點清晰，陰性無干擾，提示耐用性好，方法可行。

[參考文獻]

[1]陳震堯，陳金英，姚偉生，等.烏芪舒筋通絡片質量標準的研究[J].中國現代應用藥學，2017，34（8）：1133-1136.

[2]陳震堯，謝鍇標，姚偉生.烏芪舒筋通絡片微生物限度檢查方法學研究[J].中國當代醫藥，2017，24（18）：93-96.

[3]陳震堯，陳金英，姚偉生.烏茂舒筋通絡片中烏頭堿限量檢測方法研究[J].中國藥房2015，26（36）：5144-5146.

[4]曹國穎，胡欣，孫釗，等.醫療機構制劑生產的風險因素分析與管控[J].中國藥事，2018，32（1）：30-33.

[5]孫凱英，方宇，彭莉蓉，等.陜西省醫療機構制劑現狀與對策分析[J].中國藥事，2018，32（1）：76-81.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[M].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：988-989.

[7]陳秀梅.小兒柴桂退熱顆粒薄層色譜鑒別研究[J].襄陽職業技術學院學報，2014，13（5）：20-21.

[8]劉若軒，歐倩雯，呂竹芬，等.牛大力飲片的質量標準研究[J].今日藥學，2015，25（1）：18-20.

[9]胡少偉，鐘昆芮，楊佳，等.薄荷莖、葉中黃酮類成分在不同采收期的含量差異性研究[J].中國中藥雜志，2018，43（3）：544-550.

[10]羅宇東，譚安薔，陸施衡，等.壯藥藤苦參中強心苷的含量測定及不同產地、采收季節對藥材含量的影響[J].中國當代醫藥，2018，25（12）：14-17.

[11]唐廣應，文方杰，任一，等.續骨療傷膏的質量標準研究[J].中國藥房，2016，27（9）：1233-1235.

[12]楊曉騰，滕統華.祛風止痛膠囊質量標準研究[J].中國藥品標準，2016，17（1）：24-27.

[13]杜建紅，寇新民，王艷麗，等.HPLC測定止痛壯骨散中川續斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國執業藥師，2016，13（11）：24-30.

[14]關雪峰，田原，樊暉，等.補正續骨泡騰顆粒質量標準研究[J].遼寧中醫藥大學學報，2017，19（1）：13-15.

[15]黃慧，倪峰，郭丹，等.基于UPLC指紋圖譜的青黛提取工藝評價研究[J].中國現代應用藥學，2017，34（4）：533-537.

[16]張帆，陳越，侯文浩，等.芒果葉中總黃酮提取工藝優選[J].中國藥業，2017，26（15）：5-10.

[17]江敏瑜，閆丹，陳嬌，等.三七跌打軟膏的制備及體外透皮特性研究[J].中草藥，2017，48（22）：4639-4647.

[18]高樂，田宇柔，王鑫國，等.HPLC同時測定續斷配方顆粒中4種成分的含量[J].中藥材，2017，40（4）：884-886.

[19]廖華麗，丁冬梅，李清.防風薄層色譜指紋圖譜的建立及其方法學研究[J].山西醫科大學學報，2018，49（6）：644-650.

[20]崔璐璐.桃花藥材薄層色譜鑒別和高效液相色譜指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2017，37（2）：333-338.