樹鼩胸主動脈血管內皮細胞的分離培養與鑒定*

宋慶凱 尹博文 陳玲霞 李曉飛 苗雨潤 代解杰 孫曉梅

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，實驗樹鼩標準化與應用研究省創新團隊，昆明 650118)

血管內皮細胞(vascular endothelial cells, VECs)是存在于血管內側的單層扁平上皮細胞。它將血管內外分開，起著屏障作用。除此之外，血管內皮細胞還起著其他重要的生理功能，如：血管調節、物質轉運、凝血、免疫等。在病毒感染實驗中，血管內皮細胞也是很好的模型，如曾有學者利用人血管內皮細胞開展登革病毒、流感病毒等病毒感染機制研究。目前已有人[1]、大鼠[2]、兔[3]、犬[4]等的血管內皮細胞獲得了體外原代培養。樹鼩作為人類近親，是建立病毒感染模型很好的材料。關于樹鼩主動脈血管內皮細胞分離培養尚未見到相關報道。而由于樹鼩體型小，對于分離血管內皮細胞有一定的難度，所以，探索一種操作簡便、經濟可行的分離、原代培養方法十分必要。

1 材料

1.1 實驗動物

新生兩日齡樹鼩，飼養環境：溫度22～28 ℃，相對濕度30%～60%，噪聲 ≤ 60 dB，光照強度1001x～1501x。實驗動物來源于醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,生產許可證號SCXK(滇)K2013-0001，實驗操作在醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心實驗設施進行,使用許可證號SYXK(滇)K2013-0001。

1.2 實驗設備和試劑耗材

Forma A/B3(6Ft)生物安全柜，Forma CO2T/C 恒溫培養箱，尼康Ti倒置顯微鏡，HDR-PJ10E 攝像機，L8-80 M 超速離心機，ZD-85 雙功能氣浴振蕩器， BS100S 電子天平，TOMY-SS-325 高壓滅菌鍋；PBS(購自Thermo)，DMEM/F12 培養基(購自Gibco)，FBS(購自Hyclone)，胰蛋白酶(購自Gibco)，抗Ⅷ因子抗體(購自Millipore)，膠原酶XI，中性蛋白酶II，BSA(購自BIOSHARP)，NunclonTMSpheraTMT25培養瓶(購自Thermo)。

1.3 方法

1.3.1樹鼩主動脈血管內皮細胞的分離

1.3.1.1 組織塊培養法：取新生兩日齡樹鼩，注射過量2% 戊巴比妥鈉處以安樂死，用無菌剪取胸主動脈，在顯微操作臺下仔細去除血管外結締組織和脂肪，用眼科剪將血管延縱向剪開；在超凈工作臺上用含2% 雙抗的HBSS溶液清洗血管3次；無菌剪將血管剪碎，約1 mm3大小；用眼科鑷將組織塊夾入T25 培養瓶中；組織塊均勻放好后將瓶底朝上，向瓶內注入適量含10%新生牛血清的DMEM/F12完全培養基；放置1 h，待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.3.1.2 胰蛋白酶、膠原酶連續消化法：主動脈組織碎塊獲得過程參照1.3.1.1，組織塊中加入5 mL 0.125%胰蛋白酶消化液，置于氣浴振蕩器37 ℃消化 15 min；消化產物中加入等體積的含10%新生牛血清的DMEM/F12完全培養基終止消化；1 200 r/min 離心5 min；棄上清；加入5 mL含75 U/mL膠原酶XI、20 μg/mL中性蛋白酶II、0.5 m mol/L二硫蘇糖醇(DTT)的DMEM/F12消化液；置于孵箱 37 ℃ 180 r/min 搖動消化1 h；1 200 r/min離心5 min；棄上清；加入4 mL 完全培養基重懸接種于T25細胞瓶，置37 ℃、5% CO2培養箱培養；每隔2 d換一次液。

1.3.2細胞形態學觀察：用倒置顯微鏡對培養的原代VECs進行觀察，并拍照記錄。

1.3.3細胞傳代培養：原代培養約 10～12 d，顯微鏡觀察到細胞覆蓋培養瓶面積的 2/3 以上，約80% 的細胞匯合即可傳代。棄去培養基，PBS清洗2～3次，加入1 mL 0.125% 胰蛋白酶消化，約1 min,見內皮細胞收縮變圓，立即加入等體積的含10% 新生牛血清的 DMEM/F12 培養液終止消化，輕輕吹打混勻，1 500 r/min 離心 5 min，棄上清，加入2 mL含10% 新生牛血清的DMEM/F12培養液，制成細胞懸液，依照細胞的量按1∶2或1∶3傳代培養，隔天換液 1次。

1.3.4Ⅷ因子免疫熒光染色：取24孔板，在中間8個孔中加入細胞爬片，并將第2代細胞接種于孔中；將孔板中已爬好細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min；吸干PBS，在玻片上滴加1% BSA，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，滴加按1∶500稀釋的抗Ⅷ因子一抗，對照孔加PBS代替一抗，4 ℃過夜孵育；PBS浸洗爬片3次，每次3 min；避光加入熒光二抗，37 ℃孵育箱1 h；PBS浸洗爬片3次，每次3 min；吸干爬片上多余液體后，滴加DAPI避光孵育3 min，對標本進行染核，PBS清洗3次,每次3 min，洗去多余的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

圖1 分離得到的樹鼩血管內皮細胞注：A、B中黑色團塊為貼壁的血管組織塊。A: 組織塊培養法培養3 d，部分細胞貼壁生長(×100)； B: 組織塊培養法培養6 d(×100)；C:組織塊培養法培養15 d，細胞匯合 (×100)；D：酶消化法所得VECs培養第3 d(×100)；E：酶消化法所得VECs培養第6 d(×100)；F:酶消化法所得VECs培養第12 d，細胞匯合成單層(×100)。(標尺：100 μm)Fig.1 Isolated VECs from tree shrewNote: The black clumps in Figures A and B represent adherent vascular tissue blocks.A: Tissue culture was cultured for 3 days,and some cells adhered to the wall (×100). B: Tissue culture method for 6 days (×100); C: Tissue culture method for 15 days,cell confluence (×100); D: VECs were obtained by enzymatic digestion for 3 days (×100); E: VECs were obtained by enzymatic digestion for 6 days (×100)；F: VECs were obtained by enzymatic digestion for 12 days, cells are aggregated into monolayers (×100).(Scale:100 μm)

2 結果

2.1 形態學觀察

組織塊培養法培養1周內細胞貼壁較少，生長緩慢，7 d后細胞從團塊中大量長出且細胞生長狀況良好。酶消化法所得細胞12 h即貼壁，3～7 d生長較快。倒置顯微鏡下可見細胞貼壁生長，呈短梭形或多角形，12～15 d匯至成單層細胞，密度不勻，胞核清晰，胞漿豐富，呈現VECs典型的“鋪路石”狀(圖 1)。

2.2 免疫熒光染色

Ⅷ因子是血管內皮細胞的標志性抗原，用抗Ⅷ因子的一抗進行免疫熒光染色后，兩種方法所得細胞均可被染成綠色，細胞核被DAPI染成藍色，而陰性對照無特異性染色(圖 2)

圖2 血管內皮細胞VIII因子熒光染色結果注:A:Ⅷ因子陽性表達(×100)； B:DAPI染核(×100)； C:合并A、B(×100)。(標尺:100 μm)Fig.2 Vascular endothelial cell factor VIII staining resultNote:A:Factor Ⅷ positive expression (×100); B: Nucleus stained by DAPI(×100); C: Merge A and B(×100).(Scale:100 μm)

3 討論

目前，實驗動物主動脈血管內皮細胞的體外培養多為組織塊貼壁法[5-6]和酶消化法[7]，此外，還見到有關文獻報道將血管內壁外翻法[8]進行貼壁培養。血管內壁外翻法有一個很大的優勢，即減少了平滑肌細胞和成纖維細胞的污染，這對于本身材料有限的情況下，確保了能夠獲得高純度的細胞分離產物；但不利之處是由于細胞長時間暴露在環境中，最終活力可能會受到影響。由于本實驗材料來自于幼齡樹鼩，體型十分小，其主動脈管徑也相當小，給血管內壁外翻法分離培養帶來了很大的困難，同時需要在顯微操作臺下進行操作，技術要求高。

實驗前期，我們曾嘗試采用血管內壁外翻法來進行細胞分離，可最終未能成功。最終選擇組織塊培養法和酶消化法來進行實驗，結果顯示，兩種方法均可獲得原代血管內皮細胞。取材后只需要在顯微鏡下仔細去除血管外部多余組織，然后馬上進入消化步驟，節省了時間。而且最終分離獲得的細胞受成纖維細胞等的污染很小，完全可以考慮后期用差速貼壁和差速消化法甚至是密度梯度離心來去除污染。組織塊培養法分離獲得單層細胞周期較酶消化法長，且存在部分成纖維細胞。酶消化法消化下的細胞少，但貼壁快，匯合為單層周期短，且細胞均一。所以從實驗操作來看，采用酶消化法來分離細胞既簡便又高效。

本研究中動物是出生兩日齡樹鼩，相比于成年樹鼩，分離得到的血管內皮細胞活力應該更好，傳代次數也應該更高。這對于本實驗室后期將要進行的病毒感染性實驗帶來了很大的優勢。樹鼩作為人類近親，相比其他非人靈長類動物體型更小，繁殖周期更短等優點。此前李曉飛等[9]和王文廣等[10]已利用樹鼩開展了病毒相關性實驗。所以，建立其血管內皮細胞的體外分離培養方法，為該細胞相關的病毒感染[11-13]、信號通路、代謝、腫瘤[14]等研究帶來了便利。