犬場暴發(fā)犬瘟熱原因分析

王思瑩,呂艷麗,張兆霞,肖 園,周靂威,夏兆飛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起多種犬的一種高度接觸性、致死性傳染病。臨床上以雙相熱、急性鼻卡他、支氣管炎、卡他性肺炎、胃腸炎、神經(jīng)癥狀為特征,部分患犬的鼻鏡和爪墊可發(fā)生過度角化[1]。犬瘟熱感染率高、發(fā)病急,患犬易繼發(fā)其他病毒或細(xì)菌感染,死亡率極高,一旦暴發(fā),可對(duì)犬業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重危害[2]。近年來犬瘟熱的感染范圍不斷擴(kuò)大,成為目前對(duì)養(yǎng)犬業(yè)、野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物繁殖業(yè)影響最大的一類疫病[3]。

2017年1月,北京某犬場暴發(fā)犬瘟熱疫情,通過對(duì)犬群的病史、免疫程序、血清學(xué)和病原學(xué)檢查分析發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致犬群暴發(fā)犬瘟熱的主要原因?yàn)槿阂呙缑庖弑Ｗo(hù)力低下,從外部引進(jìn)的犬只攜帶犬瘟熱強(qiáng)毒,并未出現(xiàn)超強(qiáng)毒株。

1 發(fā)病情況

2016年10月底至11月初,該犬場先后從山東和東北地區(qū)分別引入10余只和20余只青年犬,不久后來自東北的2只犬出現(xiàn)犬瘟熱,但病犬未及時(shí)銷毀或移出場區(qū)而采用了在場區(qū)內(nèi)隔離進(jìn)行姑息治療,隨后,來自山東的犬中出現(xiàn)犬瘟熱病例。之后,病情逐步蔓延至犬場內(nèi)1歲齡左右的青年犬,多只犬CDV膠體金抗原檢測結(jié)果為陽性,部分患犬病情加重并陸續(xù)死亡。與此同時(shí),種犬場內(nèi)也發(fā)生犬瘟熱疫情,經(jīng)CDV膠體金抗原檢測,有15只犬檢測結(jié)果呈陽性。這些陽性犬只臨床癥狀輕重不一,從無癥狀、輕微臨床癥狀到嚴(yán)重臨床癥狀、死亡。本次疫情持續(xù)至2017年1月下旬,之后無新病例出現(xiàn)。

2 犬場免疫程序

該犬場犬只于1月齡時(shí)采用犬瘟熱-犬細(xì)小病毒2聯(lián)疫苗首免,然后,每間隔2周,采用犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病病毒(CPV)、犬腺病毒2型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPiV)4聯(lián)疫苗(簡稱4聯(lián)苗)進(jìn)行2免和3免;此后,與犬場其他犬只一起在春季和秋季分別加強(qiáng)免疫接種一次。在本次疫情發(fā)生前,于2016年10月進(jìn)行了最后一次免疫,該免疫程序已經(jīng)在犬場使用10余年,無犬瘟熱病例發(fā)生。

3 樣品采集與CDV膠體金抗原檢測卡現(xiàn)場檢測

本次調(diào)查對(duì)16只犬間隔1個(gè)月先后兩次采集樣本。根據(jù)初次采樣前犬場工作人員測得的CDV膠體金抗原檢測結(jié)果,將犬只分為健康組(檢測結(jié)果陰性)和發(fā)病組(檢測結(jié)果陽性),健康組編號(hào)1～6號(hào),發(fā)病組編號(hào)7～16號(hào)。樣本包括全血、血清、眼鼻口拭子以及發(fā)病組犬只的糞便樣本。為檢測犬場使用的CDV膠體金抗原檢測卡的特異性和敏感性,我們對(duì)其與北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CDV膠體金檢測卡同時(shí)對(duì)發(fā)病組的10只犬進(jìn)行了CDV抗原檢測,結(jié)果顯示,發(fā)病組的10只犬中,有5只為陽性(編號(hào)7～11號(hào)),其余犬只為陰性,詳見表2。

發(fā)病組犬只臨床表現(xiàn)：初診時(shí),7號(hào)犬極度消瘦,可視黏膜蒼白,眼角大量黃色膿性分泌物;8號(hào)犬于采樣前3天出現(xiàn)黑便,呼吸急促,鼻鏡干燥;9號(hào)犬于采樣前2天嚴(yán)重腹瀉;11號(hào)犬和13號(hào)犬發(fā)生腹瀉。其余犬只眼觀未見異常。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

初診時(shí)采集16只犬的眼鼻口拭子、糞便和血清：對(duì)初診采集的眼鼻口拭子進(jìn)行了CDV普通RT-PCR 檢測以及 CDV、CAV-1、CAV-2、CPiV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測,對(duì)血清進(jìn)行了CDV抗體效價(jià)檢測,對(duì)糞便樣本進(jìn)行了CPV-2通用和CPV-2野毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測以及寄生蟲檢查;對(duì)二診采集的樣本進(jìn)行了CDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和普通RT-PCR檢測,對(duì)血清進(jìn)行了CDV抗體效價(jià)檢測;對(duì)死亡和危重病例的DNA樣本進(jìn)行了CDV F和H基因的序列測定與分析。

4.1 CDV普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 初診和二診分別采集16只犬的眼鼻口拭子,采用本實(shí)驗(yàn)室建立的CDV RT-PCR方法對(duì)初診樣本進(jìn)行CDV核酸檢測,如表1、表2所示,健康組中2(2/6)只犬的檢測結(jié)果為陽性,發(fā)病組中7(7/10)只犬的檢測結(jié)果為陰性。對(duì)初診和二診樣本進(jìn)行了CDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測,檢測結(jié)果均為陽性,但二診檢測結(jié)果中,被檢樣本的Ct值比初診時(shí)普遍升高,提示犬體內(nèi)病毒再亮顯著降低;同時(shí)進(jìn)行了CAV-1,CAV-2和CPiV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測,對(duì)糞便樣本進(jìn)行CPV-2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,CAV-1、CPiV和CPV-2野毒均為陰性,部分犬只(12/17)呈CAV-2陽性。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司提供。

4.2 血清CDV抗體效價(jià)檢測 使用以色列Biogal公司的ImmunoComb Canine Vacci-CheckR三聯(lián)抗體試劑盒檢測健康組和發(fā)病組16只犬血清中的CDV抗體、CPV抗體和ICH(傳染性肝炎)抗體效價(jià),檢測結(jié)果見表1和表2,根據(jù)試劑盒檢測說明書,當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到S3時(shí),表示疫苗免疫成功。12月齡以上的犬初診時(shí)CDV抗體效價(jià)均達(dá)到S3(1∶32)及以上,具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力;1歲齡以下的犬,僅有3只(3/9)抗體效價(jià)達(dá)到S3及以上;發(fā)病組中死亡和危重的4只犬年齡在6～9月齡,CDV抗體均為陰性。值得注意的是,初診時(shí)5月齡的4號(hào)犬和4月齡的16號(hào)犬,二診時(shí)抗體效價(jià)均有下降。

表1 血清CDV抗體水平檢測結(jié)果

4.3 CDV F和H基因序列分析 從7、8、9號(hào)犬和10號(hào)犬眼鼻分泌物樣品提取RNA,采用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,并將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。將測序序列進(jìn)行拼接,分別得到5 229 bp的基因(檢測結(jié)果由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司提供)。序列分析顯示,4個(gè)被檢樣本的F和H基因彼此間同源性高達(dá)99%,表明親緣關(guān)系較近,可能為同一毒株或同一毒株的變異株,它們與強(qiáng)毒株CDV-RD-JL(KJ848781,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,特種野生動(dòng)植物科學(xué)研究所)親緣關(guān)系最近。

將F和H基因核苷酸序列編碼的氨基酸與CDV強(qiáng)毒和標(biāo)準(zhǔn)疫苗株進(jìn)行了遺傳演化分析。F基因的氨基酸序列對(duì)比顯示,4個(gè)毒株的氨基酸同源性在99.5%以上,與國內(nèi)狐貍源強(qiáng)毒株LN(01)1(狐貍源CDV,KP765764)同源性最高,達(dá)到98.6%以上,而與標(biāo)準(zhǔn)疫苗株CDV3同源性不到89.4%。H基因的氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示,4個(gè)毒株的氨基酸同源性高達(dá)99.7%以上,與強(qiáng)毒株LN(01)1毒株同源性在99%以上,與標(biāo)準(zhǔn)疫苗毒株CDV3同源性低于91.1%。F和H基因遺傳進(jìn)化分析顯示,這4株病毒位于同一個(gè)小分支上,其余強(qiáng)毒株在同一個(gè)大的分支上,而與疫苗株相差較遠(yuǎn)(見圖1和圖2)。

上述結(jié)果提示,該犬場感染犬的CDV毒株與強(qiáng)毒株親緣關(guān)系較近,屬于強(qiáng)毒。

圖1 CDV-F氨基酸同源性分析

4.4 糞便寄生蟲檢查 采集初診時(shí)發(fā)病組犬只的糞便樣本進(jìn)行寄生蟲檢查,有3只(3/10)犬存在賈第鞭毛蟲和毛滴蟲。

5 分析與討論

圖2 CDV-F氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 CDV-H氨基酸同源性分析

圖4 CDV-H氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

5.1 引發(fā)本次疫情的直接原因 本次疫情發(fā)生的直接原因是引入了攜帶CDV強(qiáng)毒的犬只,并且在發(fā)現(xiàn)患犬后隔離措施不當(dāng)、應(yīng)急措施不到位。疫情發(fā)生后,犬場未及時(shí)將發(fā)病犬只移出犬場,而是在場內(nèi)進(jìn)行治療,隔離措施不嚴(yán)格是導(dǎo)致疫情蔓延的主要原因。嚴(yán)格按照防控措施進(jìn)行管理對(duì)傳染病的防控極為重要,可以采用敏感性和特異性高的檢測方法,對(duì)引進(jìn)的犬只進(jìn)行重要傳染病篩查,經(jīng)檢測合格后再引進(jìn)犬只;一旦發(fā)現(xiàn)患犬,立即隔離治療,病死犬及時(shí)移出場區(qū),并對(duì)犬舍和用具進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

5.2 引發(fā)本次疫情的內(nèi)部原因 犬場內(nèi)犬只疫苗免疫保護(hù)力不足是本次疫情暴發(fā)的內(nèi)部原因,該犬場的免疫程序已經(jīng)使用十余年,是國內(nèi)多數(shù)犬場使用的免疫程序,但隨著疫苗免疫應(yīng)用研究的不斷深入,免疫程序一直在逐步優(yōu)化完善。按照疫苗研發(fā)廠家或WSAVA疫苗指導(dǎo)小組的建議,該情況下,幼犬應(yīng)該在16～20周齡時(shí)加強(qiáng)免疫接種1次,或者根據(jù)疫苗免疫抗體效價(jià)選擇合理的免疫程序。本次調(diào)查中,間隔1個(gè)月的兩次血清CDV抗體效價(jià)檢測結(jié)果表明,1歲齡以下被檢犬只疫苗免疫合格率僅為33.3%(3/9),死亡的4只犬年齡在6～9月齡,體內(nèi)均無CDV抗體;初診4月齡和5月齡的兩只犬在二診時(shí)抗體效價(jià)呈下降趨勢,前者由S5下降至S4,后者由S3下降至陰性,結(jié)合死亡犬只的抗體效價(jià)分析,疫苗免疫保護(hù)力低是疫情蔓延并且造成死亡的重要原因。應(yīng)改進(jìn)疫苗免疫程序,12周齡之前完成首輪免疫的犬可在16～20周齡時(shí)加強(qiáng)免疫1次,之后在6月齡或1歲齡時(shí)加強(qiáng)免疫1次。條件允許的情況下,推薦通過抗體效價(jià)檢測來確定免疫時(shí)機(jī)和免疫次數(shù)。

CDV核酸基因組編碼8種蛋白質(zhì),其中F蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合,影響CDV在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散能力,雖然F基因相對(duì)保守,但其微小的變化也會(huì)對(duì)CDV毒力產(chǎn)生重要改變;H蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,H基因變異可能導(dǎo)致H蛋白抗原性改變,從而使CDV逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[4],H蛋白和F蛋白變異可能是導(dǎo)致犬瘟熱在不同地區(qū)暴發(fā)的原因[5]。在疫苗免疫的壓力下,CDV易向遠(yuǎn)離疫苗株的方向發(fā)生變異,從而導(dǎo)致病毒毒力的變化,這可能是導(dǎo)致已免疫動(dòng)物仍然發(fā)病的原因之一[6]。CDV的F和H基因序列分析和遺傳演化分析結(jié)果顯示,本次導(dǎo)致疫情的毒株與國內(nèi)之前分離的狐貍源性毒株同源性高,說明犬只是感染了強(qiáng)毒株而發(fā)病。抗體效價(jià)較高的犬只雖然發(fā)生感染,但最終康復(fù),說明接種的疫苗對(duì)流行的強(qiáng)毒株有很好的抵抗力。

5.3 關(guān)于膠體金抗原檢測、普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR的敏感性和臨床應(yīng)用 發(fā)病組為采樣前經(jīng)膠體金抗原檢卡檢測為CDV陽性,這些犬部分無明顯臨床癥狀,在對(duì)其進(jìn)行再次現(xiàn)場采樣檢驗(yàn)時(shí),部分犬只檢測結(jié)果變?yōu)殛幮?經(jīng)普通RT-PCR檢測時(shí),檢出率明顯高于膠體金抗原檢測,而經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)全部為陽性,這是由于不同檢測方法的敏感性不同。結(jié)合抗體檢測結(jié)果來看,膠體金抗原檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性可能是因?yàn)榛既畽C(jī)體存在CDV特異性抗體且效價(jià)較高,抵御住了抗原侵襲。健康組中,普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR均檢測到陽性結(jié)果,說明膠體金抗原檢測的敏感性相對(duì)較低且仍有出現(xiàn)新病例的可能。二診時(shí),實(shí)時(shí)熒光PCR檢測為陽性而不表現(xiàn)臨床癥狀的犬只,應(yīng)為健康帶毒犬。犬瘟熱的主要傳染源為病犬、帶毒犬及病死犬,健康犬通常與病犬直接或間接接觸后通過氣溶膠微滴或飛沫經(jīng)呼吸道、消化道感染病毒[3],未發(fā)病犬只可能處于病毒感染的潛伏期,臨床癥狀不易被察覺。犬在感染的5～7 d開始排毒,由于檢測樣本為鼻咽拭子,如果犬未開始排毒,可導(dǎo)致病原學(xué)檢測結(jié)果為CDV陰性。