不同粒徑白頭翁散破壁率測定及小檗堿溶出度比較試驗

李艷玲,盧婷婷,劉永錄,張國祖

(河南牧業經濟學院制藥工程學院,河南 鄭州 450046)

白頭翁散由白頭翁、黃連、黃柏和秦皮組成。其功效為清熱解毒,涼血止痢。主治：熱毒赤痢,濕熱痢疾,赤多白少和發熱口渴等[1]。在獸醫臨床上應用非常廣泛。但作為散劑,藥材的吸收利用率較低,臨床用量較大,對藥材資源造成了很大的浪費。

超微粉碎技術是近20年來國際上發展起來的一項應用現代物理或化學方法對材料進行微粉化的新技術,已廣泛應用于化工、醫藥、食品、涂料等眾多領域[2]。超微粉碎技術應用到中藥制劑中同樣顯示出獨特的優勢,研究結果表明,中藥粉碎成超微粉后與用傳統散劑相比,可明顯提高藥效和產品質量。目前,獸藥市場上也出現了很多超微粉的中成藥,但沒有統一的檢測方法,因為沒有統一的標準,所以造成了市場上的魚目混珠,以普通粉代替超微粉,以次充好,給養殖業帶來了很大的經濟損失。

本課題擬在充分調研的基礎上,以白頭翁散為例,對其超微粉碎的最佳粒徑做系統的研究,力求制定出能夠很好控制超微粉質量的標準。把超微粉碎在中藥領域的應用向前推進一大步。

1 材料與試劑

1.1 藥材 白頭翁、黃連、黃柏、秦皮,購自河南中醫學院一附院,經鑒定,白頭翁是毛茛科植物白頭翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regel)的干燥根;黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的干燥根莖;黃柏是蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹皮;秦皮是木犀科植物苦櫪白蠟樹(FraxinusrhynchophyllaHance)的干燥干皮;粉碎后分別制成過60目篩、200目篩、300目篩、400目篩、500目篩的細粉。

1.2 標準品 鹽酸小檗堿(含量：86.8%,批號：110713-200208,中國藥品生物制品檢定所);

1.3 儀器 4O0 g搖擺式高速萬能粉碎機(型號OFY一400,溫嶺市林大機械有限公司);依利特高效液相(大連依利特公司);藥物溶出儀RCZ-8B(天津大學精密儀器廠);BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.4 試劑 甲醇(色譜純,鄭州派尼化學試劑廠);乙腈(色譜純,鄭州派尼化學試劑廠);H3PO4和十二烷基磺酸鈉(分析純,鄭州派尼化學試劑廠);鹽酸(煙臺市雙雙化工有限公司);三氯甲烷(天津市風船化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 細胞破壁率的測定

2.1.1 細胞計數、標準曲線繪制及最佳濃度選擇精密稱取0.0152,0.2108,0.3145,0.5256,0.6332,0.7288 g細粉,分別置于25 mL容量瓶中,加水合氯醛約20 mL,超聲處理5 min,使粉末分散均勻,用水合氯醛定容至刻度。精密吸取藥液30 μL,裝片(裝片時,使混懸液布滿整個玻片,不溢出,無氣泡為度),置Wirnier 99顯微圖像分析儀(40×)下觀察。從白頭翁散粉末顯微特征分析(見圖1、2),考察白頭翁散微粉的細胞破壁率,宜選擇其木栓細胞破壁率的測定。

圖1 60目白頭翁散顯微特征 (4×10)

因此,以白頭翁散細粉中完整的木栓細胞為顯微特征計數物指標,其多為網狀或蜂窩狀,此特征具有代表性,進行計數(一個視野為1個計數單位,每個濃度的藥液取8個計數單位的平均值)

以白頭翁散粉末稱樣量為橫坐標,每個視野中完整的木栓細胞平均數為縱坐標,繪制標準曲線,得出標準曲線方程為Y=30.867X+0.967 5,R2=0.978 8,說明白頭翁散細粉中完整木栓細胞在0.105 2-0.728 8 g范圍內線性良好,可作為顯微特征計數。

2.1.2 白頭翁散超微粉細胞破壁率的檢測 分別稱取白頭翁散60目、200目、300目、400目、500目粉,精密稱定,按2.1.1所述方法制片,于顯微鏡下觀察。分別觀察25個視野,根據兩者完整木栓細胞個數、混懸液體積、稱樣量,計算白頭翁散不同粒徑下的顯微特征個數

白頭翁散粉末顯微特征個數/mg=XV/V′W

X為每個蓋玻片下的特征數,V′為飲片混懸液總體積(mL);V為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為飲片稱取量(mg)。

再根據白頭翁散細粉和超微粉的顯微特征個數,計算細胞破壁率。破壁率Y=(A-B)/A×100%。Y為細胞破壁率,A為60目白頭翁散顯微特征個數,B分別為白頭翁散200目、300目、400目、500目的顯微特征個數。

通過以上公式,計算得出白頭翁散200目、300目、400目、500目粒徑的細胞破壁率 Y分別為38.64% 、91.94% 、94.99% 、96.95% 。

2.2 小檗堿溶出度的測定 色譜條件：流動相：乙腈：0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(45∶55)(每100毫升加十二烷基磺酸鈉0.1 g,磷酸調pH值4.0);色譜柱：依利特 C18柱;檢測波長：345 nm;流速：1 mL/min。

表2 白頭翁散粉末顯微特征(木栓細胞)個數計算的相關參數 (n=25)

采用槳狀攪拌器法,溶出介質900 mL 0.1 mol/L稀鹽酸,置于溶出杯內,加溫待溶出介質溫度恒定在37℃(±0.5℃)后,轉速為100 r/min,各個粉碎目數樣品采樣5 g精密稱定,自供試品接觸溶出介質起立即計時采樣。 (2、5、10、20、30、45、60 min)各采樣1.5 mL溶出液,立即用濾膜過濾,蒸干,加甲醇10 mL溶解定容,濾過,取續濾液,進樣20 μL,測峰面積。 結果見表2,圖3、4、5。

圖3 小檗堿標準品

圖4 白頭翁散樣品

白頭翁散中小檗堿的提取試驗結果表明：從60目到500目小檗堿的溶出量(見表3)分別是30.1%、45.5%、82.4%、83.5%、85.9%。 說明由60目到500目,在相同的提取條件下小檗堿的溶出量明顯增多,300目和80目、200目相比,小檗堿的溶出均有極顯著差異(P＜0.01),但300目和400目、500目相比,小檗堿的溶出量雖有一定的差別,但沒有顯著差異(P＞0.05)。由表2可以看出,60目和200目的白頭翁散中小檗堿的溶出比較緩慢,都是到60 min時溶出量才達到最大。而300目、400目、500目的白頭翁散中小檗堿在30 min時就已經達到最大了,雖然隨著時間的再延長會略有增加,但差異不顯著。并且,300目、400目、500目中小檗堿的溶出速度非常快,5 min時300目、400目、500目的溶出量分別是45.6%、50.1%、53.1%,比60目和200目的白頭翁散在60 min時的溶出最大量都多,有著極顯著的差異(P＜0.01)

圖5 白頭翁散超微粉小檗堿陰性

表3 不同粒徑白頭翁散中小檗堿的溶出度

3 討論

3.1 關于白頭翁散不同粒徑細胞破壁率的測定一般認為,超微粉中藥的顆粒粒徑應在l～75 μm范圍內,大多數超微粉中藥平均粒徑≤15 μm。在《中國獸藥典)2015版II部中,對粉末的分級,最細只分到200目(75 μm),并未涉及超微粉( ＜75 μm)粒徑的分等及限度[3]。其實在中藥領域的超微粉碎,最終的目的是把細胞壁打破[4],以利于有效成分的溶出。因此,破壁率的測定是中藥超微粉碎技術的所以白頭翁散經過超微粉碎后,找出粒徑和細胞破壁之間的關系,確定最佳的粉碎粒徑,就可以確定白頭翁散超微粉的粒徑在什么范圍,為控制白頭翁散超微粉的質量提供量化標準。。白頭翁散顯微特征包括石細胞、短纖維、導管、木栓細胞,通過對白頭翁散普通粉末及超微粉顯微特征的分析,其中木栓細胞呈網狀或者蜂窩狀,結構典型,適宜作為檢測指標進行破壁率的測定。試驗結果表明,白頭翁散300目的細胞破壁率已達到百分之九十以上,可以作為白頭翁散超微粉的制備工藝標準。

3.2 關于不同粒徑白頭翁散小檗堿溶出度的考察

通常認為,當藥物溶出速率成為藥物吸收的限制步驟時,藥物的生物利用度與藥物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相關性,通過適當的工藝改變藥物的溶出速率就可以提高生物利用度。排除其他因素的影響,從理論上講,藥物的溶出速率主要取決于與溶劑液體接觸的顆粒表面積的大小,而表面積與顆粒粒度成反比,所以,藥物的粒度越細,其溶出量和溶出速率也應該越快。而300目的白頭翁散中小檗堿的溶出總量和溶出速率明顯高于200目,但和400目、500目的白頭翁散相比,雖然隨著時間的再延長會略有增加,但差異不顯著。

通過以上試驗,我們確定白頭翁散粉碎到300目時細胞破壁率已經基本能達到90%以上,且小檗堿的溶出基本能夠達到理想的水平。而如果再繼續粉碎到400目、500目,其消耗會大大增加,但實際意義不大,因此我們確定白頭翁散超微粉的最佳粉碎粒徑為300目。

將中藥進行超微粉碎后,使有效成分得到了充分利用,豐富了中藥的劑型,提高了療效,和普通散劑相比,大大降低了用藥劑量,節約了藥材,保護了生態環境,應用于禽病的防治即可混飼,又可混飲,使用方便。如果能在臨床上推廣應用,必將帶來巨大的經濟效益和社會效益,為畜牧業的健康發展作出實質貢獻。