多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其系統進化分析

曹瑞勇,張振興,聶 鑫,李寶寶,黃海峰,楊小健,朱 姝,杜 麗,王鳳陽

(海南大學 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點試驗室 海口市動物基因工程重點試驗室,海南 海口 570228)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida,PM)是革蘭陰性球桿菌,無運動性、兼性厭氧,屬于巴氏桿菌屬中最重要的畜禽致病菌。該菌宿主廣泛,不同動物之間可以相互傳染。人被患病動物咬傷或抓傷時易感染該菌,引發皮膚炎癥。動物機體免疫力低下時,可以引發多種以傳染性肺炎和敗血癥為主的疾病,如禽霍亂、豬肺疫、豬進行性萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、兔鼻漏等[1]。哺乳羔羊更易感染多殺性巴氏桿菌,造成突發癥狀,患病羊畏冷戰栗、體質虛弱、呼吸困難,數分鐘至數小時內死亡[2]。多殺性巴氏桿菌可以引起多種動物的疾病,給養殖業造成了巨大的經濟損失。

海口市某黑山羊場,多只羔羊出現精神萎靡、呼吸困難、后期出現水樣腹瀉等癥狀,患病嚴重的羔羊最終常因為腹瀉虛脫而死。本試驗采集多只患病羊羔的心臟、肺臟、肝臟進行致病菌的分離培養。并通過細菌形態學觀察、生化反應試驗、多重PCR和莢膜血清型分型PCR技術最終確診該病致病菌為D型多殺性巴氏桿菌。本試驗對菌株進行毒力因子分析、藥敏試驗和系統進化樹的構建,旨在為多殺性巴氏桿菌引起的黑山羊疾病的治療提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病料和實驗動物 海南省海口市某黑山羊養殖場發病羔羊的心臟、脾臟及肝臟。SPF級KM小鼠,購自海南省藥物研究所,使用許可證號SCXK(瓊)2015-0007。

1.2 主要試驗材料 TSA、TSB培養基,購自美國BD公司;麥康凱培養基,購自廣東環凱生物有限公司;腦心浸液(BHI),購自北京陸橋生物技術有限責任公司;麥康凱瓊脂培養基、藥敏試紙,購自杭州天和微生物試劑有限公司;生化鑒定管,購自杭州天合生物有限公司。

1.3 引物合成和設計 參照崔穎鵬[3]合成細菌16S rRNA通用引物,參照Townsend等人[4]合成多殺性巴氏桿菌分型引物、毒力因子引物,送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 細菌的分離鑒定將1～2 g采集肺臟等組織研磨處理,溶于1.5 mL離心管中,離心取上清,涂布于5%綿羊脫纖維血平板(TSAB)上和麥康凱(MAC)培養基上,37℃培養18 h,對染色形態統一的菌落進行生化性質的分析測定。

1.5 細菌 16S rRNA序列分析、細菌分型和毒力基因檢測 PCR反應擴增反應體系(50 μL)：2×Premix Taq Buffer 25 μL,上游引物和下游引物各2 μL,滅菌水補足到50 μL[5]。 觀察結果,PCR 產物經回收純化送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 分離株生化反應鑒定 參考說明書接種于生化鑒定管中[6],觀察并記錄反應結果。

1.7 毒力因子檢測 用多殺巴氏桿菌D型的毒力基因引物,PCR反應,利用2%的瓊脂糖進行凝膠電泳,檢測擴增結果。

1.8 攻毒試驗 將20只健康KM雄性小鼠,隨機分為4組,每組6只,試驗組分別腹腔注射菌數為1、0.1、0.01億的菌,空白對照組注射等體積的PBS[7],觀察小鼠發病情況。取攻毒致死的小鼠和健康小鼠肺臟,制作為石蠟組織切片,進行H.E染色(圖2)。

1.9 藥物敏感試驗 按K-B紙片擴散法[8],將左氧氟沙星、慶大霉素、四環素等9種常用抗菌藥物的藥敏紙片放在含有5%胎牛血清的TSA平板上培養。記錄耐藥情況。

1.10 細菌16S rRNA進化樹分析 根據BLAST比對結果,選取不同地區的多殺性巴氏桿菌16S rRNA序列進行系統發育樹分析。利用Notepad++處理序列,利用MEGA6軟件中最大可能性法構建系統進化樹。

2 結果

2.1 分離菌株革蘭染色 將分離的菌株進行革蘭染色,油鏡下觀察,結果顯示,單一陰性球桿菌。

2.2 細菌16S rRNA測序結果及分析 對分離得到的單一菌落進行細菌16S rRNA PCR擴增,經1%凝膠電泳分析,發現確有1條大小為1 495 bp目的條帶,結果見圖1。對測序結果進行BLAST分析后發現,分離得到菌株和GenBank上公布的LT906458.1同源率為99%。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR產物

2.3 毒力因子檢測結果 根據多殺性巴氏桿菌各毒力因子的序列,分別利用不同的特異引物進行毒力因子檢測,經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明,存在tonB和tonA毒力因子,不存在ptfA毒力因子。結果見圖2。

2.4 多殺性巴氏桿菌分型結果 利用巴氏桿菌特異性分型引物進行PCR反應,經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,該菌株為D型多殺性巴氏桿菌結果見圖3。

2.5 生化反應鑒定結果 嚴格按照生化反應試劑盒操作規范對該多殺性巴氏桿菌進行生化鑒定試驗。結果見表1。

圖2 毒力因子擴增結果

圖3 多殺性巴氏桿菌分型結果

2.6 小鼠攻毒試驗,陰性小鼠,狀態良好。陽性小鼠全部死亡。經革蘭染色和多殺性巴氏桿菌特異引物鑒定,確定為致病菌。病理組織切片顯示,肺泡間隔血管充血,肺泡中有大量漿液及纖維素和紅細胞以及嗜中性粒細胞,結果見封三彩版圖4。

2.7 藥敏試驗結果 該菌對甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、四環素、慶大霉素、阿莫西林敏感;對頭孢他啶、紅霉素中敏,對氟苯尼考耐藥。

表1 生化鑒定試驗結果

2.8 系統進化分析結果 對該分離菌株的16S-rRNA序列及選取的其他地區和國外的多殺性巴氏桿菌的16S rRNA序列使用MEGA 6.0軟件中Maximum Likelihood methods成功構建出有根的、基于單個同源基因差異的系統進化樹,見圖5。結果發現,該菌株和中國河北、湖北、重慶等地分離菌株的親緣關系較近,和美國、英國、印度等地的分離菌株進化親緣關系較遠。

3 討論

多殺性巴氏桿菌普遍存在于多種動物的上呼吸道內,是一種機會致病菌,根據莢膜型分為5種,分別是 A、B、D、E、F型,血清型分類為 1 ～16型[9]。據報道多殺性巴氏桿菌B型明礬沉淀疫苗對牛羊有6個月的保護,但目前其他型的長期高效的疫苗尚在研發[10],需及時對病死羊消毒和無害化處理,能較好控制該病擴大感染范圍。

本試驗分離得到的多殺性巴氏桿菌對生長條件的要求比較苛刻,在血平板上生長良好,麥康凱培養基上不生長,普通瓊脂培養基生長貧瘠。該菌落形態一致,呈淡黃色邊緣光滑的無溶血環樣。根據構建的進化樹可知,該菌株和中國河北、湖北、重慶等地分離菌株的親緣關系較近,和美國、英國、印度等地的分離菌株進化親緣關系較遠,符合疾病流行傳播的規律,說明該型菌在我國較為統一。

圖5 多殺性巴氏桿菌進化樹建立