實時熒光定量PCR技術在糧油轉基因成分檢測中的應用

馬穎穎

（大連工業大學 遼寧 大連 116600）

1 引言

在我國，由于轉基因技術的逐漸成熟化，以前轉基因農作物還停留在實驗階段，目前開始在具體的環境中得到利用。油菜籽、玉米、大豆以及棉花是百分之九十五的轉基因農作物都集中于此。而且很多的農作物已經實現了生產上的商品化，其種植面積不斷擴大化。作為糧油質檢機構，就要在轉基因檢測中遵循準確、快速以及簡便的原則進行，在定量以及定性進行進口轉基因物的檢測技術進行加強，就要確保監督管理食品的安全性。

當前對待轉基因的食品，人們越來越重視，而且更加重視其建立相關的轉基因成分標簽制度，提高了更為嚴格的定量分析要求。在檢測轉基因的過程中采用傳統的PCR技術進行定性分析，因為反應抑制、不適當的操作以及高敏感性差導致假陽性的出現，傳統的方法已經滿足不了現在的檢測要求。因為科學技術的成熟化，實時熒光定量PCR技術的不斷創新，其操作簡單、特異性強、具有很高的靈敏度，可以定量地分析DNA模板，而且可以實時地檢測、沒有產生污染、結果準確度高以及可以實現自動化等優勢。

2 實時熒光定量PCR技術

2.1 實時熒光定量

傳統PCR技術是可以定性進行，隨著發展出現了實時熒光定量PCR技（(Realtime PCR），它可以實現定量核酸的技術。在美國AppliedBiosystems公司此技術就是由此開始的，就是利用熒光基團加入到PCR的反應體系中，而且檢測的熒光信號強度以及DNA數量關系是線性相關。可以實時地對整個PCR進程在熒光信號的積累下進行檢測，進一步DNA擴增曲線就刻意得到，對于定量分析未知模板時其中之一的方式就是可以利用標準曲線進行。在PCR反應中，DNA拷貝數就會產生，而且增大反應循環數，DNA拷貝數增加是以指數的形式進入到平臺期，實時熒光定量PCR技術和傳統的PCR技術相比較，由于傳統上定量分析PCR采用終點法存在缺陷，但實時技術可以彌補其缺陷，可以實時地在PCR反應擴增中進行檢測，而且熒光信號經過連續的分析，就會擴增，當熒光信號被檢測出，就會得到曲線。

所以指數期間時PCR反應可以進行對PCR產物量的檢測，在某一個點進行，進一步對模板的起始含量進行推斷。實時熒光定量PCR反應時，處于指數期，為了更為對樣本進行檢測，要進行熒光信號閾值的設置，而且熒光的本底信號是基于PCR反應之前的循環熒光信號進行，數量確定15個。樣本的域值循環數Ct就可以用此進行定義，其模板的Ct值和模板起始拷貝數對數是線性相關，Ct值隨著起始拷貝數的增加值越來越小。對于未知樣品Ct值，利用標準的曲線就可以對樣品的起始拷貝數進行計算。

2.2 實時熒光

PCR類型進行實時地定量分析時有兩種方式：非探針類(SYBR Green)以及探針類，采用Tapman探針。前者擴增產物的原理就是利用特殊的設計或者染料進行，易操作，低成本，但是特異性低；后者對引物進行指引的增加是用和靶序列特異進行雜交的探針進行，優勢就是特異性較高。

2.3 實時熒光定量PCR技術要求

2.3.1 實驗室條件 根據《轉基因產品檢測實驗室技術要求》(GB/T19495.2—2004)的相關要求設立PCR實驗室，而且檢測質量以及實驗室的總體規定應該遵循，糧食機構就是定量定性地檢測對植物的樣本的轉基因。在對轉基因進行檢測的實驗室內，對于實驗的各區域避免不相關的人員進入。檢驗核酸時，如果條件允許，當區域進行隔開時，就要有緩沖間的設置，而且緩沖間相連的工作區域壓力規定為正值，緩沖間為負壓，為了以免因為空氣的流動，導致所處的環境遭到污染，就要有連鎖的裝置的安裝在緩沖間以及工作間之間。檢驗不同種類的核酸時，工作區域應該相互獨立，之間不能對開門，并用標志進行區分。若是區域之間是相連的，要將物品傳遞窗進行安裝，對此工作區就有要求，要進行254nm波長的紫外燈的安裝，而且是40W的，每隔20m2區域進行安裝，燈和地面距離誤差在2.0±0.1m范圍。

由于實驗室的工作區域就是對試劑進行制備的區域，主要進行分裝試劑、制備貯存的試劑以及制備在主反應的混合液，所以就要進行設置。要注意的是，沒有對控制氣流壓力有嚴格的規定，但是壓力梯度，為了以相鄰間的氣溶膠流動污染，就要規定為正值，和鄰近區相反，注意在本區域盡量避免走動。在區域進行試劑的原材料貯存，而且它的制備也要在區域進行。處理樣品就要提取樣品的核酸，進一步進行貯存，混合液進行擴增。

3 結語

傳統的熒光定量采用的是終點檢測的方式，但是利用PCR技術，可以實現沒有后處理的步驟，如不需要進行電泳，而且打破傳統方式，分析利用的是閉管，當檢測人員檢測時，其目的產物同位素具有放射性，但是可以避免，而且核酸擴增物會產生交叉的污染，但是利用此技術可以降低。所以，此技術實現了檢測更為靈敏，檢測時間減少，由于傳統檢測速度慢、而且并不具有特異性，PCR技術可以實現其提高，不僅在檢測致病菌上得以使用。而且在定量定性檢測糧油轉基因成分時，廣泛利用實時熒光定量PCR技術，促進了在以后致病菌以及糧油轉基因成分的發展中更具有潛力。

[1]許安君.實時熒光定量PCR技術在糧油轉基因成分檢測中的應用[J].糧油食品科技，2013，21(02):68-70.

[2]吳永彬.食品中轉基因成分的定量檢測研究[D].南方醫科大學，2012.

[3]曾瑩.轉基因大豆、玉米特異品系LAMP檢測方法的研究[D].福建農林大學，2013.