微小組織病理技術

楊旭

（湖北省恩施州動物疫病預防控制中心，恩施 445000）

0 引言

病理技術是病例診斷的前提，同時也是病理研究領域的重要方法學，因此在生物醫療活動中發揮十分關鍵的作用。然而由于當前各種針吸檢查與內窺鏡檢查的普遍應用，使這些檢查送檢的標本數量不斷增加，這些標本均呈現米粒狀、針尖狀等。對微小組織進行制片的過程十分復雜，極易導致組織缺失或摻雜別的組織，使標本被污染，因此需要在病理技術方面進行改進。

1 微小標本預處理方法

對微小活檢組織的預處理十分重要。合理的預處理能縮短制片時間，最大限度還原組織形態和病理特征，做出準確診斷。鄭玉琴[1]研究發現，對微小組織標本的固定效果，對病例診斷的準確程度產生較大的影響。很多內窺鏡均是通過多點取材的方式，組織標本延擱予濾紙上面，無法有效固定，易導致一些微小組織標本由于標底濾紙吸水，組織標本牢固地吸附于濾紙上面不能分離，即使強行將其取下，也會粘帶肉眼不可見的濾紙纖維，極大地影響微小組織的固定，使切片很容易碎裂，降低診斷的準確性。借助光面白紙可以處理標底紙對組織標本吸水過多、防止微小組織不易同襯底分離、粘帶紙纖維等情況。避免制片中的組織出現碎裂的情況，提高制片質量。微小組織能與普通外科手術標本共同浸蠟、脫水，不用專門解決，使操作流程更加簡便。掌握微小組織的固定、脫水等預處理流程，便可得到完整、清楚的微小組織切片，有效地提升診斷與組織標本分類、分型的準確程度。

2 微小組織快速冰凍切片法

由于科學技術的快速進步，冰凍切片不斷成為病理科眾多工作中重要內容之一，為進行準確的術中診斷提供基礎。由于醫療技術水平的日益提升以及醫學技術的逐漸發展，使人們越來越關注健康的重要性。臨床醫生與病人要求對直徑3 mm以下的微小組織進行迅速正確的診斷，由于這些組織的體積過小，對其進行制片與診斷并不容易，阻礙該項工作的實施。為更好地處理該問題，研究人員做了大量探索、改進，取得一些進展。微小組織在冰凍切片中的包埋是一大難題，用半導體切片機通過瓊脂包埋，使微小組織或破碎組織不僅能進行冰凍切片，而且切片形態保持完整，效果較好。梁忠泉[2]等使用甲基纖維素替代OCT包埋劑，并將原組織包埋托進行完善，令切片刀同組織包埋托的接觸面積不斷減少，有利于對組織標本進行觀察，不會破壞刀口，修切時應避免把組織樣本切完。在被打濕的小濾紙片上滴少量液體膠，再把微小組織平放于滴有少量液體膠的小濾紙上方，最后放于冷臺上冷凍3～5 min再實施切片。

3 微小組織石蠟包埋切片法

石蠟塊可以長時間保存，良好的微小組織切片既能給臨床科室與病人提供充足的時間，還能有效地提升臨床診斷與組織樣本分類分型的準確程度。微小組織由于組織體積小，通過脫水等相關處理后，會逐漸縮小，因此容易丟失。脫水后組織顏色為灰白色，不易被發現，特別是包埋后與蠟的顏色相近，導致切片時不容易發現組織。將組織放入微孔包埋盒中，立即投入含有2%伊紅、0.9%氯化鈉溶液中，浸泡30 min左右，使組織著色。用擦鏡紙將固定好的微小組織包裹，放入包埋盒中進行脫水。微小組織由于體積較小，脫水時間與常規脫水時間不同。采用超聲微波法，分別將100%乙醇、丙酮以及二甲苯放在預熱鋁板上進行脫水、透明，以縮短脫水透明時間。將95%乙醇、無水乙醇、二甲苯放入80 ℃烘箱中以縮短脫水透明時間。蠟塊包埋時，較小組織不易將其包埋在中間，采用預包埋法，將微小組織先用熔化的蠟液包埋，利用后加注的蠟液溫度將預包埋的蠟逐漸熔化，冷卻成型后，使組織與蠟完全融為一體，使其固定于包埋模中央，便于切片。對細針穿刺微小組織進行滴膠石蠟雙重包埋的方法，該方法對細胞學診斷具有較高的實用價值。將合成膠水作為預包埋材料，主要是考慮到針吸組織的體積小，不利于尋找，直接石蠟包埋十分復雜，只有進行預包埋后，使組織微粒裹成型，體積變大，有利于脫水、透明操作。合成膠水為高分子化合物，主要是借助淀粉通過酸化或熱處理后生成的糊精樣產物，極易溶解在熱水中，但不能溶解在乙醇中，按照該特性把通過膠水包埋的組織投放入乙醇中，在脫水時膠滴不斷凝聚成型，有助于進行石蠟雙重包埋，操作便捷。微小組織必須借助伊紅指示著色，進而在包埋后有助于判斷其同附近蠟面的界限與預測切片的深度，而且，切片刀較為鋒利，在操作時應該小心、謹慎，借助微調手輪對露出的切面進行修整。滴膠預包埋借助凹孔有機玻璃板把微小微粒組織集中到同一個平面上，使其不易分散、漂浮，避免切片不完整導致漏診情況的發生。通常針吸微小組織滴膠包埋后應該借助單獨脫水的方式，由于膠滴在凝固后密度增加，同時組織包裹中的水很難滲透出來，因此浸蠟、脫水以及透明需要合理增加時間，確保制片的效果[3]。

4 微小組織HE染色和免疫組化研究

由于微小組織體積小，因此對染料滲透性較好。改進傳統的HE染色步驟，先將微小活檢組織進行HE染色，之后進行系列脫水、包埋、切片。用紙片將每個送檢微小組織連同病理編號一起包好，滴加伊紅染液，用鋼圈固定后進行微小組織的固定、脫水、透明、浸蠟，制作的蠟塊能連續切片，蠟帶舒展、良好，展片無皺褶，HE染色后各種細胞成分著色鮮艷，能滿足診斷的要求。微量組織的HE染色時需用熱水反藍，既能預防細胞核退行性染色過度，又能將組織邊緣多余的包埋試劑（如膠質）殘留污漬清洗溶解，使切片明亮潔凈。

微量組織進行組織化學染色雖然無特殊之處，但是對于微量組織組化操作依然需要謹慎對待。如組織過小，操作中易脫落，因此需控制好操作時間和力度。在實驗室常規操作中對微量組織的組化操作進行一系列優化：第一，切片烘烤要充分，否則組織微粒甚小、附著力較差容易造成脫片；第二，在梯度酒精水化步驟適當縮短時間；第三，縮短抗原修復時間；第四，孵育微量抗體時加蓋蓋玻片，防止少量抗體揮發，使有限的抗體覆蓋均勻。同時，應該也探索微量組織的高通量和組織芯片組操作技術，將數十至上百個甚至更多小的組織整齊有序地排列在一張載玻片上制成縮微組織芯片，即組織切片。這樣既充分利用切片的空間，又節省操作時間，還可以對大量組織進行同一化操作，使試驗結果更具有可比性，增強免疫組化結果的可信度和正確性。

5 結束語

微小組織病理切片制作是對病理技術的一大考驗。使用有顏色的染料將組織染色，在組織包埋中易于識別，極大地提高包埋速度和質量。而且染色組織在白色蠟塊中非常醒目，容易掌握蠟塊的切修深度，確保切片的質量，便于病理診斷。隨著醫學科學技術的不斷提高，所取組織的體積將會越來越小，因此需要不斷地提高病理技術，為病理診斷提供優質的切片。充分了解微小組織的固定、脫水浸蠟、包埋、冷凍、切片和染色等幾個方面的程序，便可以制出組織完整、清楚以及色澤鮮艷的微小組織切片，以期有效提升診斷與組織分類分型的準確程度。