健骨方對早中期膝骨關節炎MMP-13、TIMP1及IL-1β的影響?

鐘傳棋，楊功旭△，戴政文，張 清

(1.湖北省中醫院，武漢 430061;2.湖北省中醫藥研究院，武漢 430074)

骨關節炎是指由多種因素引起關節軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導致的關節疾病。軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原、蛋白多糖、基質金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)等共同維持關節軟骨的完整性和功能性；炎癥因子IL-1β參與骨關節炎軟骨基質降解，是經典的炎癥調節劑，是炎癥調節的始動因素[1]。健骨方是本科經驗方，以軟骨肝脾腎藏象屬性為切入點，臨床治療膝骨關節炎療效肯定，但其作用機制有待進一步的深入研究[2-3]。本研究通過觀察健骨方治療早中期膝骨關節炎療效及對MMP-13、TIMP1、IL-1β的影響，探討健骨方治療骨關節炎可能存在的作用機理，現報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2017年1月至2017年12月本院骨科就診的膝骨關節炎患者60例，按隨機數字表法分為健骨方組(治療組)和硫酸氨基葡萄糖組(對照組)每組各30例。

1.2 診斷標準

參照骨關節炎診治指南(2007年版)[4]：①近1個月內反復膝關節疼痛；②X線片(站立或負重位)示關節間隙變窄、軟骨下骨硬化和(或)囊性變、關節緣骨贅形成；③關節液(至少2次)清亮、黏稠，WBC<2000個/ml；④中老年患者(≥40歲)；⑤晨僵≤30 min；⑥活動時有骨摩擦音(感)。綜合臨床、實驗室及X線檢查，符合①+②條或①+③+⑤+⑥條或①+④+⑤+⑥條，可診斷膝關節骨關節炎。

1.3 疾病分級

參照Holden膝關節骨關節炎的X線診斷分級標準[2]。0級：正常；I級：關節間隙可疑變窄，可能有骨贅；II級：有明顯的骨贅，關節間隙輕度變窄；III級：中等量骨贅，關節間隙變窄較明確，軟骨下骨骨質輕度硬化改變且范圍較小；IV級：大量骨贅形成可波及軟骨面，關節間隙明顯變窄，硬化改變極為明顯，關節肥大及明顯畸形。

1.4 納入標準[2]

符合骨關節炎診斷標準，滿足①+②+③+④條；X線診斷分級標準符合0級、I級、II級、III級；符合肝脾腎虧虛表現，關節隱隱作痛、酸軟，舌質淡苔白或有齒痕或舌質淡紅、苔白；近期未接受其他方式治療或服用其他藥物；愿意配合觀察且隨訪時間在3周以上。

1.5 排除標準[2]

符合診斷標準但未按要求療程用藥，或隨訪中斷者；哺乳期、妊娠期或正準備妊娠的婦女；合并有嚴重的原發疾病，如心腦血管疾病、肝腎功能異常等；病情危重，不能正確評估藥物的有效性和安全性；X線診斷分級為IV級；不屬于藥物作用范圍的病例。

1.6 方法[2]

1.6.1 治療組 健骨湯組方：枸杞子10 g，山茱萸10 g，鹿角片20 g，黃芪30 g，黨參10 g，茯苓10 g，白術20 g，炙甘草6 g，白芍10 g，獨活6 g，細辛3 g，制附片6 g，雞內金15 g，補骨脂10 g，懷牛膝30 g。藥材由湖北省中醫院中藥房統一提供、煎制，煎煮2次后濃縮至200 ml，分早晚2次口服，每次100 ml，4周為1個療程。

1.6.2 對照組 采用口服關節軟骨保護劑硫酸氨基葡萄糖膠囊(臺灣信東生技股份有限公司)，每次口服2粒，每日3次，4周為1個療程。治療期間禁止使用其他影響骨關節炎的藥物，所有患者盡量休息，患肢防寒保暖并避免負重。

1.7 觀察指標

1.7.1 VAS 量表 VAS 量表[5]采用視覺類比量表(VAS 法) 及臨床癥狀快速判定疼痛程度。

1.7.2 WOMAS指數 WOMAS骨性關節炎指數[6]是國際上較公認的評價標準，主要觀察膝關節疼痛、僵硬和功能3項指標并進行量化評分計算改善率。

1.7.3 MMP-13、TIMP1、IL-1β檢測 治療前及4周后抽取患者患肢關節液注入試管，離心取上清液于-20℃保存，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測治療后關節液中MMP-13、TIMP1、IL-1β含量。從-20℃冰箱內取出標本，室溫下復融標本；所有試劑在使用前平衡至溫室20℃～25℃；準備工作：標準品液配制，使用前加入0.5 ml蒸餾水混勻，配成4000 pg/ml的溶液，設標準管8管，每管加入標本稀釋液200 μl，在第1管中加入4000 pg/ml的標準品溶液200 μl混勻后用加樣器吸出200 μl移至第2管，如此反復做對倍稀釋，從第7管中吸出200 μl棄去，第8管為空白對照。10x標本稀釋液用蒸餾水做1∶10倍稀釋，洗滌液用重蒸水1∶20稀釋。加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100 μl，將反應板充分混勻后置37℃120 min。洗板3次：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液100 μl,將反應板充分混勻后置37℃60 min。30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值并記錄。

1.8 療效評定標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[4]。臨床控制: 疼痛等癥狀消失，關節活動正常，X 線顯示正常；顯效：疼痛等癥狀消失，關節活動不受限，X 線顯示明顯好轉；有效:疼痛等癥狀基本消失，關節活動輕度受限，X 線顯示有好轉；無效: 疼痛等癥狀與關節活動無明顯改善，X 線無改變。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料

本研究60例患者均獲得隨訪，平均年齡(60.24±4.67)歲，2組病例性別、年齡、病程、病情等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。治療組治療后VAS評分較治療前降低、疼痛減輕，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組治療前后WOMAS指數明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05)，總體療效優于對照組(P<0.05)；治療組治療前后MMP-13、IL-1β水平顯著下降(P<0.01)，TIMP1無明顯改變(P>0.05)。

2.2 治療前后治療組相關指標變化

3 討論

本研究病證結合，根據骨關節炎診斷及分級標準，結合中醫證候分型選擇早中期膝骨關節炎患者,以骨關節炎的退變核心軟骨病理改變為切入點進行臨床研究。軟骨細胞占軟骨組織體積的3%,其主要功能是通過分泌Ⅱ型膠原、蛋白多糖、基質金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs),維持關節軟骨的完整性和功能性。MMPs是1組能夠降解細胞外基質的內肽酶，在膝骨關節炎軟骨基質降解期發揮重要作用，其中MMP-13可以直接降解軟骨基質中的Ⅱ型膠原，而且其他許多亞型MMPs對型膠原的降解需要通過它起作用。TIMPs是阻斷細胞外基質降解、抑制MMPs活性的1組分泌糖蛋白，它參與組織結構的建立與維持。TIMP1是TIMPs 4種當中的1種，能抑制絕大多數的MMPs[7-8]。MMPs與TIMPs之間的動態平衡打破是骨關節炎發生發展的重要原因。本研究中對照組及治療組治療后關節液中MMP-13水平均下降，TIMP1均無明顯改變，MMP-13、TIMP1兩者之間無明顯相關性。

表1 健骨方對VAS評分、WOMAS指數、MMP-13、TIMP1、IL-1β的影響

注：與對照組比較：#P<0.05，##P<0.01；治療前后比較：*P<0.05

白細胞介素-1(IL-1)能促進軟骨基質分解代謝，增加基質金屬蛋白酶mRNA的表達，導致各種MMPs的合成與分泌增加，抑制TIMPs的促進合成作用，使MMPs/TIMPs動態平衡被打破，導致關節軟骨組織代謝失調，出現骨關節炎的典型癥狀。MMPs/TIMPs的比值與軟骨破壞的程度有關，軟骨破壞嚴重時這一比值相應增大，膠原的溶解會加劇，軟骨的變性會加重[9]。IL-1β是IL-1的主要成分，正常情況下僅存在于個別表層關節軟骨細胞之中，而在骨關節炎患者軟骨細胞和滑膜細胞中均可見高水平表達，被認為是最經典的炎癥調節劑，是炎癥調節的始動因素。已有證據表明，IL-1β在軟骨細胞的降解、退變過程中起最重要的分解作用[10-11]。本研究中治療組IL-1β在治療后明顯下降，證明在膝關節炎早期服用健骨方是延緩骨關節炎快速發展的有效措施。

本方從補肝脾腎論治骨關節炎，方中枸杞子滋補肝腎之陰，其為平補腎精肝血之品；山茱萸補益肝腎、收斂固澀，性溫而不燥，補而不峻，補益肝腎，既能益精又可助陽，為平補陰陽之要藥；鹿角片(鹿角霜)補腎助陽，強筋健骨；補骨脂補腎壯陽、溫脾止瀉；懷牛膝補肝腎、強筋骨。補脾藥黃芪甘溫，善入脾胃，為補中益氣要藥；黨參性味甘平，主歸脾肺二經，以補脾肺之氣為主要作用；茯苓利水滲濕，健脾寧心；白術益氣健脾，燥濕利水，是“脾臟補氣健脾第一要藥”；雞內金消食健胃，炙甘草補益脾氣、緩急止痛、調和諸藥，另加白芍養陰柔肝止痛[12]。健骨方在骨關節炎早中期以軟骨藏象屬性為切入點，從補肝脾腎方向進行防治，能保持治療的連貫性，臨床療效肯定。研究中健骨方VAS評分提示其止痛效果良好，能保證患者較好的依從性，可長期服用，值得臨床推廣應用。

有研究顯示，健骨方能有效影響p38 MAPK 表達水平，降低軟骨損傷的組織學評分，抑制軟骨退變[13-14]。本研究顯示，健骨方能抑制MMP-13、IL-1β水平，其可能是通過改善基質金屬蛋白酶及炎癥因子水平，抑制軟骨退變，從而起到治療骨關節炎的作用。健骨方治療骨關節炎信號通路研究及方中重要單藥成分研究是我們今后的研究重點。