補腎活血方調節淋巴回流對小鼠骨關節炎的影響?

石繼祥，商培洋，周 旭，周 強，章篩林，龐金輝，周軍杰，虞陸超， 衛彥強，郝勝坤，王文燕，莊偉康，朱鵬飛

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院， 上海市普陀區中心醫院骨科,上海 200062)

淋巴系統作為免疫系統重要組成部分，其主要功能是將組織液轉輸到血管而重入血循環，這對人體維持內穩態至關重要[1]。淋巴回流功能一旦發生障礙，其結果必然是組織液過剩而出現機體水腫，隨之而來的是代謝產物、炎性因子等局部蓄積，從而導致包括膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)在內的多種疾病的發生與發展[2]。本課題組前期研究已發現，KOA多有關節腫脹、疼痛，且病程中伴隨著明顯的淋巴管結構及功能變化，表明淋巴管功能障礙可能是KOA的重要機制之一[3]。KOA屬于中醫學“痹癥”“骨痹”等范疇，其病機為肝腎虧虛，外邪乘虛襲于經絡，屬本虛標實之證，臨床治療常以補腎活血為主。根據傳統中醫理論，同時結合我院傷科經驗，自擬補腎活血方隨證加減，可有效緩解KOA關節腫脹、疼痛等癥狀，促進膝關節功能恢復且療效確切[4-5]。本研究擬觀察補腎活血方對KOA小鼠淋巴管功能的調節作用，為進一步深入探討其作用機制提供依據。

1 材料

1.1 實驗藥物

補腎活血方組成：懷牛膝12 g，骨碎補12 g，補骨脂10 g，水蛭5 g，雞血藤30 g，黃芪24 g，川芎12 g，當歸24 g，熟地黃24 g，甘草9 g等，由上海中醫藥大學附屬普陀醫院/普陀區中心醫院藥劑科提供。將小鼠(20 g)與人(60 kg)的常規中藥用量按《實驗動物藥理學》進行換算(換算系數9.01)，則小鼠所服補腎活血方(166 g)煎劑濃度為1.75 g/ml；取上述中藥5劑加5倍水(4150 ml)浸泡30 min，煮沸后繼續煎煮30 min，以消毒紗布過濾得首煎液；所余藥渣再加5倍水(4150 ml)，重復以上步驟得次煎液；將2次煎液混合后加熱濃縮至477 ml，得補腎活血方濃縮煎劑，-80℃冰箱保存以備用。

1.2 主要試劑與儀器

高精確電子天平(Biotech德國)；TP1020型組織脫水機、RM2135型輪轉式切片機、HI1220型烘片機、OLYMPUS BX50熒光顯微鏡、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡(LEICA德國)；BX-50型生物倒置顯微鏡(Olympus日本)；JEM-1200EX 透射電鏡圖像數字分析儀(Bio-Rad美國)；小動物麻醉機(Matrx VMR 美國)；近紅外成像系統(Fluoptics-Hubtech21 Inc.美國)；吲哚菁綠(ICG，Acorn美國)；異氟烷(深圳沃瑞德科技有限公司NO.217140901)等。

1.3 實驗動物

SPF級10周齡雄性C57BL/6 小鼠30只，體質量(23 ±2)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(動物許可證號SCXK(滬)2017-0005)。SPF級動物房中飼養，室溫15～25℃，濕度 45%～60%，標準飼料喂養，常規飲水。適應性飼養2周后，小鼠隨機分成假手術組、模型組和補腎活血方組3組各10只。所有實驗獲得上海中醫藥大學附屬普陀醫院醫學實驗動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 動物分組及造模

模型組(meniscal-ligamentous injury induced osteoarthritis，MLI-OA，半月板副韌帶損傷OA模型)及補腎活血方組小鼠均采用右膝關節內側皮膚切口，以膝關節為中心，長約5 mm，暴露并切斷內側副韌帶后打開膝關節，找到內側半月板前部并分離其與脛骨的附著點，然后切除內側半月板前部，縫合皮膚關閉切口；假手術組小鼠皮膚切口相同，但只切開關節囊而不切斷其他結構[3,6]。

2.2 藥物干預

造模結束后，術后第2天補腎活血方組小鼠即開始灌胃給藥，每次灌胃量為0.2 ml/只；假手術組和模型組小鼠則給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，4周為1個療程，持續12周。

2.3 膝關節腫脹度測量

在造模當天及術后4、8、12周分別測量小鼠腫脹程度。用游標卡尺測量每組小鼠右膝關節橫向直徑(mm)，計算膝關節腫脹度(%)[7]，公式為：膝關節腫脹度(%)=(右膝關節直徑-左膝關節直徑)/左膝關節直徑×100。

2.4 淋巴管回流功能檢測

每4周使用近紅外線-吲哚菁綠成像系統(indocyanine green-near infrared，NIR-ICG) 檢測淋巴管回流變化情況，將小鼠使用異氟烷麻醉后雙下肢脫毛，以30號針頭注射10 μL的ICG(濃度為0.1μg/ml，蒸餾水溶解，避光保存)染料于小鼠髕韌帶中間注入關節腔內，在NIR照射下觀察熒光信號，淋巴管的信號強度趨于穩定后觀測24 h (期間每隔1 s拍照1次，圖片保存以備分析)，記錄信號漸由膝關節經集合淋巴管進入腹股溝淋巴結過程。使用Image J軟件可計算膝關節ICG的信號強度(signal，S)及達峰時間(Tmax)變化情況；并計算膝關節周圍淋巴管的ICG清除率[3,8-9]，如ICG注射后6 h的清除率(Clearance)=(S6h-S1h)/ S1h×100%。

2.5 組織病理學檢測及評分

于術后4、12周處死小鼠，每組5只，剔除周圍皮膚及肌肉，完整膝關節進行10%福爾馬林固定后，用10% EDTA脫鈣，每日更換新鮮液，直至組織軟化為止約3～4周。脫鈣后流水沖洗24 h除酸，常規脫水、透明、浸蠟、切片。層厚4 μm，進行Safranin-O染色。顯微鏡下觀察關節軟骨細胞及細胞外基質的染色情況和結構的完整性，以及軟骨縱裂或侵蝕的深度，并依據Safranin-O染色進行OARSI評分(見附表1)[10]。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 補腎活血方對小鼠關節腫脹度的影響

表1顯示，測量小鼠右膝關節橫徑以分析其腫脹度變化，結果模型組小鼠右膝關節腫脹度于術后4、8、12周呈現顯著上升(與假手術組比較，P<0.01)，表明模型組小鼠患側膝關節存在持續的炎癥反應；補腎活血方小鼠術后仍有關節腫脹，但已明顯緩解(與模型組比較，術后8周，P<0.05；術后12周，P<0.01)。

表1 小鼠膝關節腫脹度變化比較

注：與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；##P<0.01

3.2 補腎活血方對小鼠淋巴管回流功能影響

圖1表2顯示，ICG微注射入膝關節腔后使用NIR-ICG系統行淋巴管功能檢測，記錄其ROI(region of interest，箭頭所示)區域ICG信號強度并使用Image J行定量分析；同時記錄分析ICG 清除率(ICG clearance)及達峰時間(Tmax)。術后12周，模型組小鼠淋巴管回流功能明顯減弱，表現為ICG清除率顯著下降(6 h、12 h及24 h，與假手術組比較，P<0.05或P<0.01)，ICG達峰時間Tmax延長(與假手術組比較:P<0.01)；補腎活血方可改善小鼠ICG清除率(與模型組比較，6 h為P<0.05，12 h及24 h為P<0.01)，同時可縮短ICG達峰時間Tmax(與模型組比較:P<0.01)，表明其小鼠淋巴管回流功能得到改善。

3.3 補腎活血方對小鼠膝關節組織病理學的影響

圖2表3顯示，石蠟切片、 Safranin-O染色后鏡下觀察， 假手術組小鼠關節軟骨表面光滑、完整，軟骨層無裂縫、侵蝕；軟骨細胞規則排列于軟骨陷窩內呈柱狀排列，軟骨細胞數量、形態無異常；模型組小鼠術后12周呈現OA典型表現，包括軟骨裂隙(紅箭頭)、關節游離體(綠箭頭)及關節軟骨丟失(黑箭頭)，補腎活血方組小鼠術后12周軟骨丟失明顯改善；其OARSI評分亦顯著下降(與模型組比較，術后12周，P<0.05)、關節軟骨丟失面積亦有所減少(與模型組比較，術后12周，P<0.01)，提示補腎活血中藥可有效延緩關節退變。

注：ICG微注射后使用NIR-ICG系統顯影成像，記錄其ROI(region of interest，箭頭所示)區域ICG光信號強度并使用Image J行定量分析。圖中顯示注射后1、6、12及24 h后ICG強度在各組變化情況圖1 小鼠膝關節淋巴回流功能檢測

4 討論

眾所周知，關節周圍物質和能量代謝“動態平衡”是保證關節正常功能的關鍵。維持這種“動態平衡”主要依賴于淋巴管。淋巴管包括毛細淋巴管及成熟淋巴管2種，它們在形態、細胞組成及功能上均存在差異。毛細淋巴管主要由排列疏松的淋巴管內皮細胞組成，而成熟的淋巴管除有緊密吻合的淋巴管內皮細胞外，外層還覆蓋可特異性表達a平滑肌蛋白，并具有收縮功能的淋巴管平滑肌細胞，而管腔內還有防止淋巴倒流的瓣膜，淋巴管平滑肌細胞收縮和瓣膜共同構成“淋巴泵”，促進淋巴回流以協助單向收集淋巴液[11-12]，最后流入靜脈，是組織液流入血液的媒介，被稱為“第二循環系統”。淋巴系統的回流功能正常與否取決于其結構是否完整，尤其是成熟淋巴管的數量分布。

表2 各組小鼠淋巴管回流功能比較

注：與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表3 各組小鼠膝關節組織病理學變化

注：與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

注：石蠟切片， Safranin-O染色后鏡下觀察。模型組術后12周呈現OA典型表現，包括軟骨裂隙(紅箭頭)、關節游離體(綠箭頭)及關節軟骨丟失(黑箭頭)，補腎活血方組術后12周軟骨丟失明顯改善圖2 小鼠膝關節組織病理學檢測

一直以來(1990年前)，OA被認為是“磨損”(wear and tear)導致關節軟骨破壞形成的骨關節病。隨著研究的逐漸深入，目前已公認OA是一種炎癥性疾病而非單純的骨關節病[13]。早在2010年，Zhou等[14]利用吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)近 紅 外(near Infrared，NIR)淋巴成像技術，檢測急慢性炎性關節炎(包括OA及RA等)的淋巴管回流功能，提示在炎性關節炎過程中淋巴管功能發生改變。Xu H等[15]、Walsh DA等[16]及Shi[3]等的研究中，在OA患者關節滑膜組織中伴隨淋巴管數量、結構及功能改變；而在OA小鼠關節周圍毛細淋巴管增加，但成熟淋巴管形成減少、淋巴回流下降，同時伴隨軟骨下骨髓水腫；由此可見，淋巴增生可能是OA重要的病理機制之一，而促進增生的毛細淋巴管成熟，增強其淋巴回流功能，將炎癥介質及時清除將是OA治療的新方向。已有研究結果表明，改善淋巴回流功能有利于TKA(終末期OA)術后患者的恢復[2]；Zhou等[17]采用重組過表達血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-c，VEGF-C)腺病毒，注射到同為炎性關節炎的RA小鼠踝關節內，3個月后其淋巴回流功能增強，淋巴管生成增加，同時踝關節內滑膜炎癥減輕。Zgraggen 等[18]的研究同樣證實，淋巴管的生成參與慢性炎癥、過敏性疾病等過程。2015年Liang等[19]的研究表明，阻斷淋巴管生成及淋巴回流功能，無論是小鼠RA還是OA，其病情均明顯加快加重，與中醫“痹癥”的發病類似。

中醫對于“痹病”(OA)病因病機的闡述最早見于《黃帝內經》。《素問·痹論》指出：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也?！闭J為該病的主要病因是正氣不足、風寒濕邪侵襲所致。以內因肝腎氣血虧虛、風寒濕邪外襲、痰濕互結、痹阻經絡為主要病因病機，因此扶正祛邪、補腎活血通絡為其重要的治療法則。補腎活血方是依據傳統中醫理論結合上海許氏傷科經驗擬定而成，已應用臨床多年且療效確切[4-5]。方中骨碎補、補骨脂、熟地黃、懷牛膝補益肝腎，強筋壯骨；黃芪、當歸補益氣血；雞血藤、水蛭活血破瘀；甘草調和諸藥，諸藥合用共奏補益肝腎、活血逐瘀之功?，F代研究亦發現，補腎活血通絡類中藥可有效抑制炎性因子，如白細胞介素-1、6，腫瘤壞死因子-α等分泌，阻斷骨關節炎癥反應[20]，降低關節一氧化氮水平，延緩關節退變[21-22]，其具體靶點尚無定論。本研究結果顯示，補腎活血方可有效改善OA模型組小鼠膝關節腫脹度，降低其OARSI評分，延緩關節退變，同時促進淋巴管回流功能，在ICG達峰時間縮短的同時，淋巴管清除率上升，證實補腎活血方治療組淋巴管功能有所改善，清除能力得到提高。這些初步研究提示，淋巴管有可能是該方消腫及延緩關節炎癥及軟骨退變的可能機制，即促進淋巴回流而改善膝關節內環境代謝障礙(炎癥介質蓄積)，促進局部微循環，加速炎癥介質及分解酶類，如基質金屬蛋白酶及整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶等有害物質的代謝，從而達到消除關節腫脹、延緩關節退變的作用。無須諱言，淋巴功能和OA相關性的研究目前仍屬于相對較新的領域，其中還有很多問題尚未厘清。如OA炎癥與淋巴管增生和功能究竟存在何種因果關系？補腎活血中藥如何影響淋巴管生成和淋巴回流功能，其中的分子機制是什么，又是通過哪些信號通路實現的，這些問題急需進一步解決。之后本課題組將對補腎活血方中中藥各主要有效成分進行系統分析，利用基因芯片等技術對其靶基因、信號通路分子進行篩選驗證，深入探討其對淋巴管增生、成熟及回流功能的作用效應、靶點及其相關物質基礎，以便探索其延緩OA的淋巴機制，解密其“除痹”密碼。