無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)在胎兒染色體非整倍體疾病篩查中的應(yīng)用*

侯亞萍，楊潔霞，郭芳芳，齊一鳴，彭海山，王東梅，歐陽浩新，尹愛華△

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣州 511442；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 511442)

目前，我國的出生缺陷發(fā)病率為4%～6%，每年新增出生缺陷兒高達(dá)80～120萬[1]，而染色體異常在其中占重要比例[2]。迄今為止，染色體異常尚無有效的治療手段，故早期的產(chǎn)前篩查及診斷尤為重要。目前，預(yù)防出生缺陷廣泛應(yīng)用的檢測(cè)手段之一是基于血清學(xué)篩查和超聲篩查評(píng)估染色體拷貝數(shù)異常的風(fēng)險(xiǎn)，但該檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性不高，篩查假陽性率高，產(chǎn)前診斷率較低[3]。而介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)因其具有有創(chuàng)性，存在對(duì)孕婦造成宮內(nèi)感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，這也一定程度上制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用[4]。1997年，LO等[5]在孕婦外周血中首次發(fā)現(xiàn)了胎兒游離DNA(cffDNA)段，由此為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使利用孕婦外周血檢測(cè)胎兒染色體疾病和基因疾病成為可能。隨著分子遺傳學(xué)及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)技術(shù)以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已廣泛用于臨床。本研究通過回顧性分析廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心自愿行NIPT孕婦的產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局，綜合分析NIPT技術(shù)在胎兒染色體非整倍體疾病篩查領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年6月至2015年11月來廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心就診的經(jīng)知情同意自愿接受NIPT的10周以上單胎妊娠孕婦5 946例(近期未接受過異體輸血、細(xì)胞治療、移植手術(shù)等，體質(zhì)量<100 kg)作為研究對(duì)象，NIPT指征情況：唐氏篩查結(jié)果異常4 525(76.10%)，B超提示異常183例(3.08%)，既往有不良孕產(chǎn)史186例(3.13%)，高齡889例(14.95%)，傳染病19例(0.32%)，錯(cuò)過唐氏篩查144例(2.42%)。孕婦年齡17～50歲，平均(29.28±2.12)歲。對(duì)孕婦均提供遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1血清學(xué)篩查 當(dāng)天采集孕婦空腹靜脈血2 mL測(cè)量胎兒頸項(xiàng)透明層厚度(NT)，分離血清進(jìn)行測(cè)定。采用芬蘭Perkin Elmer公司生產(chǎn)的DELFLA-1235型全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光分析儀及配套試劑檢測(cè)孕婦人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)和血清甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)水平，并結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、孕周、單/雙胎、是否有吸煙飲酒史、采樣時(shí)間等指標(biāo)，應(yīng)用芬蘭Perkin Elmer公司提供的LifeCycle 3.2唐氏篩查風(fēng)險(xiǎn)軟件進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1.2.2超聲檢查 孕婦在孕早期(11～13+6周)時(shí)采用彩色多普勒超聲測(cè)量胎兒NT，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)參照英國胎兒醫(yī)學(xué)基金會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。若NT>2.5 mm者，建議進(jìn)行NIPT或侵入性產(chǎn)前診斷檢查，并跟蹤隨訪妊娠結(jié)局。

1.2.3NIPT 獲得孕婦知情同意且符合條件的孕婦，采用Cell-Free DNA BCTTM管(美國Streck公司)抽取靜脈血10 mL，并立即在4 ℃條件下48 h內(nèi)進(jìn)行血漿分離并保存于-80 ℃待測(cè)。采用QIAamp DNA Micro試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行血漿胎兒游離DNA提取。采用文庫構(gòu)建試劑盒(中國博奧公司)進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建后，用Sequencing kit V3測(cè)序試劑盒對(duì)待測(cè)文庫在Proton測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。通過分析不同染色體水平的差異識(shí)別胎兒染色體非整倍體異常，并計(jì)算出胎兒患染色體非整倍體疾病的風(fēng)險(xiǎn)概率[6]。

1.3產(chǎn)前診斷及隨訪 對(duì)唐氏篩查高危、NT異常者建議進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷檢查，拒絕行產(chǎn)前診斷者可自主選擇NIPT。NIPT結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，建議繼續(xù)妊娠并在醫(yī)生指導(dǎo)下進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前檢查；而結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者，建議行胎兒染色體核型分析，以核實(shí)無創(chuàng)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)所有接受篩查孕婦的妊娠結(jié)局進(jìn)行跟蹤隨訪。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究中所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2007及SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)專業(yè)分析軟件進(jìn)行分析處理，其中高通量測(cè)序檢測(cè)胎兒患染色體非整倍體疾病的風(fēng)險(xiǎn)(21/18/13-三體綜合征等)概率由專用的無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理系統(tǒng)軟件基于二元假設(shè)的Z-score值判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1唐氏篩查結(jié)果 在行NIPT的5 946例孕婦中，唐氏篩查異常者4 525例，其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)2 341例(51.73%)，21-三體臨界高風(fēng)險(xiǎn)1 773例(39.18%)，18-三體高風(fēng)險(xiǎn)71例(1.57%)，18-三體臨界高風(fēng)險(xiǎn)28例(0.62%)，其他指標(biāo)異常312例(6.90%)。

2.2NIPT結(jié)果 在行NIPT的5 946例孕婦中，共檢出62例異常者，其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)17例(27.42%)，18-三體高風(fēng)險(xiǎn)10例(16.13%)，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)3例(4.84%)，性染色體異常15例(24.19%)，其他染色體異常17例(27.42%)。

2.3羊水穿刺檢查及妊娠結(jié)局隨訪 見表1。結(jié)合羊水/臍血穿刺及隨訪結(jié)果，本研究5 946例孕婦行NIPT的結(jié)果提示異常者62例，經(jīng)產(chǎn)前診斷及隨訪確診者62例。其中2例NIPT未發(fā)現(xiàn)異常，但后期超聲檢查發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)確認(rèn)為18-三體綜合征。本研究中NIPT胎兒21/18/13號(hào)染色體非整倍體異常的靈敏度為92.59%(25/27)，特異度為99.92%(5 914/5 919)，假陰性率為7.41%(2/27)，假陽性率為0.08%(5/5 919)。NIPT提示性染色體異常的15例中10例經(jīng)羊水/臍血穿刺檢查確診為性染色體異常，而5例經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)及后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)異常。NIPT性染色體異常的靈敏度為100.00%(10/10)，特異度為99.92%(5 931/5 936)，假陰性率為0.00%(0/15)，假陽性率為0.08%(5/5 936)。在NIPT提示其他染色體異常的17例中，僅1例提示18號(hào)染色體缺失者經(jīng)羊水穿刺-微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢查結(jié)果為46,XN,del(18)(q22.3)，確認(rèn)NIPT結(jié)果正確，其他16例經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)及后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討 論

中國每年出生的新生兒約有1 600萬，其中僅因染色體異常引起的新生兒出生缺陷約為0.6%[1,7]。臨床上，胎兒染色體非整倍體是出生缺陷中的主要疾病[2]。隨著國家計(jì)劃生育政策放寬，高齡孕婦數(shù)量明顯增多，深入開展產(chǎn)前診斷與篩查，降低出生缺陷，提高人口素質(zhì)顯得尤為重要。目前，我國針對(duì)妊娠早、中期18～34歲孕婦推行的是血清學(xué)產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷模式。在本研究5 946例行NIPT的孕婦中，唐氏篩查異常者4 525例，占總樣本量的76.10%。但經(jīng)過NIPT和羊水/臍血穿刺檢查及妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)可見，唐氏篩查檢測(cè)結(jié)果具有假陽性高、特異度差、影響因素較多的特性和不足，故唐氏篩查異常者需進(jìn)一步進(jìn)行檢查確認(rèn)。而被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”的傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法是侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)，因其有創(chuàng)性、風(fēng)險(xiǎn)性，常常給孕婦及家屬造成較大的心理壓力而難以被廣泛接受[4]。尤其現(xiàn)在二胎政策放開后，孕婦數(shù)量，特別是高齡孕婦明顯增多，血清學(xué)篩查及侵入性產(chǎn)前診斷方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及社會(huì)的需求。

由于NIPT技術(shù)具有高通量、自動(dòng)化、無創(chuàng)、快速等特點(diǎn)，在國內(nèi)外廣受關(guān)注，且該新興技術(shù)已廣泛用于臨床診斷胎兒非整倍染色體異常等方面。本研究中5 946例行NIPT的孕婦中，篩查胎兒21/18/13號(hào)染色體非整倍體異常的靈敏度為92.59%(25/27)，特異度為99.92%(5 914/5 919)，假陰性率為7.41%(2/27)，假陽性率為0.08%(5/5919)。靈敏度及特異度稍高，假陽性率及假陰性率與之相似。靈敏度及特異度偏高考慮與樣本量偏小，檢測(cè)標(biāo)本多為唐氏篩查高危者，低風(fēng)險(xiǎn)者比例小有關(guān)。

NIPT是產(chǎn)前篩查手段的巨大進(jìn)步，也是無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)未來發(fā)展的趨勢(shì)[8]。盡管NIPT具有很多優(yōu)點(diǎn)，但目前仍存在一定局限性，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。此外，因NIPT的對(duì)象是母體血漿中的胎兒游離DNA，并非直接獲取胎兒的遺傳物質(zhì)，故仍存在假陽性及假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。本研究共發(fā)現(xiàn)有2例21-三體假陽性，1例18-三體假陽性，2例13-三體假陽性和2例18-三體假陰性，假陰性率為7.41%，假陽性率為0.08%。初步推測(cè)可能與母體因素和胎盤嵌合有關(guān)，目前仍在進(jìn)行深入驗(yàn)證分析工作。有研究亦認(rèn)為，胎兒游離DNA主要源于凋亡的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞[9]，故限定性胎盤嵌合體[10]、母體染色體異常[11]、胎盤發(fā)生病變或異常等情況均可影響NIPT結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。因此，NIPT結(jié)果為陽性者，建議進(jìn)一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢查進(jìn)行確認(rèn)，并及時(shí)追蹤隨訪。

綜上所述，NIPT技術(shù)是一種無創(chuàng)、快捷、準(zhǔn)確的產(chǎn)前篩查新技術(shù)。隨著NIPT樣本的不斷積累和技術(shù)的優(yōu)化，其準(zhǔn)確性和局限性將進(jìn)一步改善，并將成為產(chǎn)前篩查技術(shù)未來發(fā)展的大趨勢(shì)，但目前仍有待完善之處，尚不能取代傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)。故在現(xiàn)有技術(shù)條件下，尚需不斷完善，并與多種產(chǎn)前篩查技術(shù)相互配合，才能提高染色體異常性疾病的檢出率，達(dá)到降低出生缺陷發(fā)生率、提高人口素質(zhì)的目的。

[1]孫成銘,欒材富.基因診斷技術(shù)在出生缺陷與遺傳病檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(4):252-255.

[2]李燕芳，張?zhí)m珍，田耕，等.胎兒游離DNA用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)21、18、13三體綜合征的臨床研究[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2015，16(2):126-129.

[3]ALLDRED S K,TAKWOINGI Y,GUO B,et al.First trimester serum tests for down′s syndrome screening[J].Cochrane Database Syst Rev,2015,30(11):CD011975.

[4]GRACE M R,HARDISTY E,DOTTERS-KATZ S K,et al.Cell-Free DNA Screening:complexities and Challenges of Clinical Implementation[J].Obstet Gynecol Surv,2016,71(8):477-487.

[5]LO Y M,CORBETTA N,CHAMBERLAIN P F,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350 (9076):485-487.

[6]CHIU R W,AKOLEKAR R,ZHENG Y W,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing:large scale validity study[J].BMJ,2011,342(11):c7401.

[7]王慶琴，劉萍，郝明，等.產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查[J].河北醫(yī)藥，2016，38(10):1581-1584.

[8]CUCKLE H,BENN P,PERGAMENT E.Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy as a clinical service[J].Clin Biochem,2015,48(15):932-941.

[9]SIFAKIS S,KOUKOU Z,SPANDIDOS D A.Cell-free fetal DNA and pregnancy-related complications[J].Mol Med Rep,2015,11(4):2367-2372.

[10]MARDY A,WAPNER R J.Confined placental mosaicism and its impact on confirmation of NIPT results[J].Am J Med Genet C Semin Med Genet,2016,172(2):118-122.

[11]VAN OPSTAL D,SREBNIAK M I.Cytogenetic confirmation of a positive NIPT result:evidence-based choice between chorionic villus sampling and amniocentesis depending on chromosome aberration[J].Expert Rev Mol Diagn,2016,16(5):513-520.

[12]TAGLAUER E S,WILKINS-HAUG L,BIANCHI D W.Review:cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease[J].Placenta,2014,35(Suppl 35):S64-S68.