胞膜小凹和窖蛋白在心臟缺血再灌注損傷中保護作用的研究進展

薛紫怡 王佳琬 吳安石

心血管系統疾病是目前全世界人類患病率和病死率上升的主要原因。研究發現細胞表面的特殊結構：胞膜小凹(caveolae)及其結構蛋白均與心血管疾病密切相關，它們與特定的信號分子相互作用，對動脈粥樣硬化、心律失常、心肌肥大、心臟缺血再灌注(ischimia-reperfusion, I/R)損傷都有著重要調節作用。本文就其在心臟缺血再灌注損傷中所起的心臟保護作一綜述，旨在為今后的基礎研究與臨床治療提供思路。

1.細胞膜小凹和窖蛋白的簡介

“小凹”(caveolae)，是細胞膜上一種富含膽固醇和鞘脂類的燒瓶樣內陷結構，其標記蛋白是窖蛋白(caveolins)，又稱“小凹蛋白”[1]。自1953年,第一次在電子顯微鏡發現以來，目前,已發現caveolae與諸多臨床疾病相關，例如脂代謝障礙、肌萎縮、心血管疾病及癌癥[2]。窖蛋白有三種異構體caveolin1～3(cav1～3)， cav-1主要存在于內皮細胞、脂肪細胞、纖維細胞中; cav-3主要存在于橫紋肌細胞(如骨骼肌和心肌細胞)和平滑肌細胞中,是與心血管疾病密切相關的重要蛋白[3]。窖蛋白作為信號分子的分子伴侶和腳手架蛋白，在時間和空間上調節暫時聚集在小凹的信號分子及其傳導，例如G蛋白耦聯受體(G-coupled receptors， GPCRs)、酪氨酸激酶(tyrosine kinase， RTK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K/ protein kinaseB,Akt)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和腺苷酸環化酶(adenylyl cyclase, AC)均與caveolins的腳手架結構域(caveolin scaffold domain，CSD)相互作用，并能增強或抑制信號蛋白轉導的能力[4]。有報道提示 caveolins可以直接與細胞器相互作用，例如肌漿網和線粒體[5]，促進和調節細胞內的代謝過程。窖蛋白還有其他的功能，包括囊泡轉運、膽固醇平衡、鈣穩態和T管形成[6]。

2.窖蛋白在心臟缺血再灌注性損傷預處理中的保護作用

心臟缺血再灌注(I/R)損傷和心肌梗死(miocardial infarction, MI)是臨床上導致患者死亡的重要原因。因此，對于如何保護心臟抵抗I/R損傷也是心臟保護研究領域一直以來迫切關注的問題。小凹和窖蛋白與心臟保護密不可分，在缺血預處理(ischemia preconditioning，IPC)和后處理(ischemic postconditioning，IPTC)、吸入性麻醉藥預處理、阿片類藥物預處理中發揮重要作用。

(1)窖蛋白在心臟IPC和IPTC中的保護作用 ①窖蛋白在IPC和IPTC保護作用的分子機制IPC是指當心臟暴露在一次簡短的缺血后(5min左右)會產生對耐受更長時間缺血的保護作用。IPC又被稱為雙相事件，其中急性相立刻發生在IPC后，持續約1～2h。延遲相的保護作用發生在初始刺激的12～24h并會持續72h。后處理指缺血心肌在經歷長時間再灌注前，接受反復、短暫的再灌注-缺血，可以減輕IR損傷。預處理主要通過三種平行的信號通路發揮作用，包括GPCR和利尿鈉肽誘發的一氧化氮信號通路、再灌注損傷挽救激酶系統(reperfusion injury salvage kinase，RISK)、生存活化因子增強途徑。后處理主要涉及RISK通路[7]。許多參與信號轉導通路的信號分子與caveolae和caveolins相互作用，包括GPCRs、RTK、NOS、PKC、PI3K等[4]。最近研究表明 MG53與cav-3和PI3K的相互作用對于IPC/IPTC誘導的RISK信號通路的激活十分重要。MG53也稱作TRIM72， N端與cav-3相互作用，C端SPRY結構域與PI3K結合，

形成cav-3-MG53-PI3K復合體發揮作用[8]。其他證據顯示IPC可以調節caveolae的微環境使具有心臟保護功能的蛋白增加，例如 eNOS和葡萄糖轉運體4(GLUT-4)，GLUT-4會移位到caveolae中[9]。最近Sun 等發現,胞外鈣敏感受體(CaSR)的激活在IPC誘導的心臟保護中起重要作用[10]。

②窖蛋白與線粒體相關的保護作用 線粒體被認為是心臟保護性干預措施IPC和IPTC的最終效應器。組織缺血會導致ATP的消耗和細胞內鈣超載，電子傳遞鏈的破壞和線粒體鈣超載會引起活性氧自由基爆發，導致線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的開放和進一步心肌能量的削減。因此，線粒體被認為是細胞死亡的核心環節或最終執行器。有研究表明細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)和Akt可阻斷糖原合成激酶-3β(glycogen synthase Kinase-3β, GSk-3β)介導的mPTP開放[11]。Hernandez的實驗表明在IPTC的大鼠模型中ERK1/2,Akt 和GSk-3β會借助cav-3形成的結構轉移到線粒體，調節mPTP的開放，產生心臟保護作用[12]。根據心肌細胞中線粒體的亞細胞定位分布，分為兩種線粒體，肌膜下線粒體(subsarcolemmal mitochondria,SSM)和肌纖維間線粒體(interfibrillar mitochondria,IFM)。由于肌膜下線粒體SSM離caveolae距離較近，因此窖蛋白介導的心臟保護性信號可能更傾向于肌膜下線粒體SSM[13]。Sun J等人發現IPC會導致肌膜下線粒體eNOS和cav-3的表達增多，由此增強了肌膜下線粒體eNOS/NO/S-亞硝基的信號通路活性[14]。線粒體蛋白是S-亞硝基化的主要靶蛋白，NO-介導的S亞硝基化通路會增強IPC誘導的心臟保護作用[15]。

③ 窖蛋白與心臟能量攝取和轉運相關的保護作用 心臟需要很高的能量需求，這對維持心臟的收縮功能、離子穩態和代謝過程是必不可少的。在心肌細胞中，基礎的葡萄糖攝取是由葡萄糖轉運蛋-1(Glucose transporter type 1，GLUT-1)介導的，由于心臟做工的增加或者胰島素的刺激會導致細胞膜上GLUT-4的轉位和葡萄糖攝取增加[16]。最近的研究表明，caveolae對于細胞的新陳代謝也起重要作用。Tsutsumi等報道,心肌缺血會激活葡萄糖的攝取，這一過程主要依賴GLUT-4從胞內的小泡易位到肌纖維膜完成[17]。Koneru等發現, IPC會激活Akt/eNOS/Cav-3信號通路從而使心臟中GLUT-4轉位到肌纖維膜[18]。

(2)窖蛋白與吸入性麻醉藥預處理的心臟保護作用 吸入麻醉藥已經使用超過了150年，但確切的機制仍不清楚。吸入性麻醉藥是短鏈的鹵代烷烴類和醚類，不僅可以與細胞膜上的脂質相互作用，并且可以直接或間接地與膜上結合的蛋白相互作用并產生一系列的細胞內效應，例如caveolins.許多研究顯示，吸入性麻醉藥可以與IPC產生相似的心臟保護作用，并且麻醉藥預處理(APC)涉及的信號轉導分子也同樣是IPC過程中所涉及的，包括G蛋白的激活、第二信使的觸發、多種蛋白激酶的活化、一氧化氮的生成和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的釋放、維持細胞內和線粒體內的鈣穩態和調節腺苷三磷酸敏感性K通道的開放[19]。APC也是雙相事件；急性相在預處理刺激下1～2h立即生成并涉及一些蛋白的磷酸化和易位，延遲相的保護作用在預處理后幾天效果明顯放大并涉及蛋白質的從頭合成[20]。

異氟醚能保護心肌細胞免受低氧環境引發的細胞死亡。野生型小鼠的心臟在進行異氟醚預處理和IPC后，Src基因(sarcoma gene)表達產物和cav-1磷酸化水平會快速上升。Src抑制劑(PP2)會降低心臟中和Src基因表達產物和cav-1磷酸化水平，由此異氟醚誘導的心臟保護作用也消失了[21]。Tsutsumi等觀察到，cav-3在APC誘導的延遲相心臟保護作用是必不可少的，同時，cav-3和GLUT-4共同定位或易位到caveoale中，提示了APC延遲相的心臟保護作用依賴cav-3和GLUT-4的移位和相互作用[22]。Wang等發現，異氟醚預處理會使cav-1和cav-3從caveoale移動到線粒體并富集，這一過程依賴GPCR/Gi信號通路[23]。最近，Jianli Zhao實驗室發現七氟烷主要是通過cav-3來抑制環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)及其超氧化物的生成，從而保護心臟抵抗I/R損傷[24]。

(3)窖蛋白與阿片類藥物預處理的心臟保護作用 阿片，是一種神經激素，可以從神經末梢中釋放，也可以在心肌細胞中合成。在心臟中，阿片受體對于調節β腎上腺素受體的信號轉導、興奮收縮耦聯以及心臟發育都十分重要[25]。阿片預處理對心臟的保護作用主要通過δ-阿片受體(δ-OR)介導。Tsutsumi等報道,cav-3過表達(cav-3OE)小鼠產生的內源性保護作用也依賴于δ-OR。此外， cav-3使阿片受體匯集到caveoale中，cav-3的表達對于δ-OR誘導的心臟保護作用是必不可少的[26]。然而SeeHoe等認為,阿片預處理的心臟保護作用也分為急性阿片受體激活和持續阿片受體激活(SOA)，并且這兩種機制略有不同。β環糊精(MβCD)可以破壞細胞膜上的膽固醇，cav-3缺乏的小鼠細胞膜缺乏caveolae結構，兩者都可以削弱δ-OR 介導的保護作用，然而SOA對于細胞膜上膽固醇的清除不如急性受體激活敏感，并且不依賴于cav-3的表達和caveoale[27]，因此更多關于阿片類藥物預處理的潛在機制有待實驗證實。

4.窖蛋白與心血管疾病的治療 他汀類藥物，被廣泛使用于降脂治療，并具有提高NO的生物利用度、改善內皮功能、增強抗氧化能力和抗炎等特質，使用在預防和治療冠狀動脈疾病。一項最近的臨床實驗顯示，圍手術期使用辛伐他汀(simvastatin)可以顯著降低非冠狀動脈手術患者的心肌損傷和炎性反應，主要是通過增加熱休克蛋白90 (heat shock proteins90, Hsp90)的表達和降低cav-1表達進而激活eNOS信號系統[28]。辛伐他汀的這種保護作用與血脂降低水平無關，提示通過改變窖蛋白水平可以有效治療心臟缺血性疾病。此外，Oshikawa等提出, 細胞外超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)定位在小凹中，并且能催化從超氧化物到H2O2的歧化作用，這對于全面激活血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信號系統和促進缺血后的血管生成都具有重要意義[29]。因此，在心血管疾病中小凹可作為一個潛在的治療靶向。

5.小結 窖蛋白及其相關的信號分子在IPC/IPTC、APC和阿片類藥物預處理介導的心臟保護作用發揮重要的橋梁作用。目前已經證實，caveolins可以保護心臟抵抗I/R損傷和心臟重構，由此窖蛋白也許是一個理想的治療靶方向，但仍需要更多的動物實驗和臨床實驗去證實其可行性。