過表達(dá)SIAH1通過上調(diào)Hrk表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

錢立勇，楊志強(qiáng)，溫媛媛

（舟山醫(yī)院，浙江 舟山 316021，1.病理診斷中心；2.呼吸內(nèi)科）

SIAH1（seven in absentia homolog 1）是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)蛋白。SIAH1是果蠅屬SINA（Drosophila seven in absentia）蛋白的同系物[1-2]。YOSHIBAYASHI等[3]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SIAH1可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中SIAH1可顯著激活由輻射誘發(fā)的凋亡[4]。Hrk（Harikari）與Bim（Bcl-2-interacting mediator of cell death）同屬于BH3亞家族成員。Hrk最初由INOHARA等[5]在Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Hrk mRNA在人類淋巴組織、胰腺、骨髓和脾臟中高表達(dá)，在腎臟、肝臟、肺和腦組織中不表達(dá)。我們最近發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系中，過表達(dá)SIAH1可以通過激活MAPK/JNK通路來上調(diào)Bim的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[6-7]。Hrk與Bim同屬于BH3亞家族成員，Hrk在SIAH1調(diào)控細(xì)胞凋亡中的作用尚未明確。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測乳腺組織中SIAH1與Hrk蛋白的表達(dá)，并分析二者與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用Western blot法與RT-PCR法檢測SIAH1與Hrk在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)情況。通過轉(zhuǎn)染SIAH1表達(dá)質(zhì)粒和Hrk siRNA，分析SIAH1與Hrk的表達(dá)及乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2000年1月至2014年12月舟山醫(yī)院病理科女性乳腺手術(shù)切除標(biāo)本，包括86例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其對(duì)應(yīng)的32例癌旁正常組織。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色后明確診斷。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意。

86例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本中，腫瘤直徑＜3 cm者48例，≥3 cm者38例；根據(jù)2010年乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[8-9]，臨床分期顯示I+II期47例，III+IV期39例；根據(jù)2012年WHO推薦的乳腺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[10]，病理分級(jí)I+II級(jí)44例，III級(jí)42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。

1.2 主要試劑 免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司，SIAH1抗體、Hrk抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SIAH1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc由Matsuzawa Shu-ichi教授（美國加利福尼亞拉霍亞伯納姆研究所）惠贈(zèng)，Hrk siRNA檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Cell Signaling公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒購自大連Takara公司，PCR引物合成與測序委托大連Takara公司完成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：組織標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片。采用SP法，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行抗SIAH1（1∶400）、Hrk（1∶400）抗體免疫組織化學(xué)染色，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性片作陽性對(duì)照。結(jié)果判定：SIAH1和Hrk以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按SIAH1和Hrk表達(dá)百分率分為4個(gè)等級(jí)：0%為0分，1%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：0分為無陽性細(xì)胞，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色。以陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分＜4為陰性，積分≥4為陽性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及RNA干擾：共培養(yǎng)2種乳腺細(xì)胞系，包括乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，細(xì)胞均為貼壁生長的細(xì)胞系。細(xì)胞接種在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將各質(zhì)?；蚋蓴_片段轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中，具體步驟：將MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為無胎牛血清無抗生素培養(yǎng)基（雙無培養(yǎng)基），饑餓細(xì)胞3 h以便提高轉(zhuǎn)染效率。將24 μg SIAH1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1、24 μg對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc、10 μg Hrk siRNA干擾片段、10 μg control siRNA分別與1.5 mL雙無培養(yǎng)基室溫下混勻，分別為pcDNA3-SIAH1組、pcDNA3組、Hrk siRNA組、control siRNA組，未處理組使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，即含胎牛血清與抗生素的培養(yǎng)基，取60 μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000與1.5 mL雙無培養(yǎng)基混勻，室溫孵育5 min，將稀釋后的質(zhì)?；蚋蓴_片段與Lipofectamine2000混勻，室溫孵育20 min，將上述混勻的混合液加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞MCF-7中，6 h后換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步檢測。共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1+Hrk siRNA方法，即pcDNA3-SIAH1+Hrk siRNA組為按上述步驟轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1 36 h后，將10 μg Hrk siRNA/雙無培養(yǎng)基的混合液與脂質(zhì)體Lipofectamine2000/雙無培養(yǎng)基的混合液混勻后加入，6 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3.3 Western blot：收集細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗3次，加入500 μL細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑復(fù)合物冰浴下超聲處理，4 ℃靜置24 h，4 ℃、13 000 r/min離心30 min，提取總蛋白。加樣，上樣蛋白量為60 μg。經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳1.5 h后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下5%正常小牛血清封閉2 h，將膜放在含一抗的封閉液中，一抗分別為山羊抗人SIAH1（1∶400），山羊抗人Hrk（1∶400）和抗β-actin（1∶200），4 ℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次10 min，然后加入二抗中（1∶2 000），室溫孵育2 h，ECL發(fā)光。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，將目的蛋白與β-actin光密度值作為相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 RT-PCR：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后，反轉(zhuǎn)錄使用OligoDT引物，合成cDNA條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃5 min。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增mRNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物經(jīng)GeneBank上Blast比對(duì)后合成，以β-actin為內(nèi)參。PCR引物為SIAH1：上游：5’-TCCAACAATGACTTGGCGAGT-3’，下游：5’-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG-3’；Hrk：上游：5’-CGATCC ACACGGAGTACTTG-3’，下游：5’-GGATGCAGAAGGAGATCA CTG-3’；β-actin：上游：5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。擴(kuò)增體系為30個(gè)循環(huán)，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析，測定擴(kuò)增帶灰度值，得到mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×104/mL的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。收集細(xì)胞，加入300 μL的1×binding buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μL的An-nexin V-FITC混勻后進(jìn)行Annexin V-FITC標(biāo)記，最后加入5 μL的PI染色，經(jīng)處理過的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。結(jié)果分析中左上象限代表壞死細(xì)胞，左下象限代表正常細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ±s表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIAH1與Hrk蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性 SIAH1與Hrk蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒，見圖1。SIAH1與Hrk在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，陽性率分別為32.5%（28/86）、37.2%（32/86）。在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中陽性率分別為84.4%（27/32）、87.5%（28/32），2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.348、7.125，P＜0.01）。在浸潤性導(dǎo)管癌中，SIAH1與Hrk表達(dá)均為陽性的標(biāo)本共23例，表達(dá)均陰性的標(biāo)本49例。Spearman相關(guān)性分析顯示，SIAH1與Hrk表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.515，P＜0.01），見表1。不同病理分級(jí)、臨床分期乳腺浸潤性導(dǎo)管癌SIAH1與Hrk蛋白表達(dá)陽性率比較顯示，SIAH1和Hrk蛋白陽性表達(dá)與乳腺癌的高病理分級(jí)（χ2=8.403、8.514，P＜0.01）、低臨床分期（χ2=6.731、6.729，P＜0.05）顯著相關(guān)。SIAH1和Hrk的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

圖1 SIAH1與Hrk在乳腺組織中的表達(dá)情況（SP法，×200）

表1 SIAH1與Hrk在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的相關(guān)性分析（n=86）

表2 SIAH1與Hrk在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析[ n=86，n（%）]

2.2 SIAH1與Hrk在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá) SIAH1與Hrk在乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A中蛋白（t=4.459、5.102，P＜0.05）與mRNA（t=6.127、5.483，P＜0.05）表達(dá)量明顯高于在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中過表達(dá)SIAH1可上調(diào)Hrk的表達(dá) 在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，使用SIAH1過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1與對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc后，結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3-myc和未處理組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1后SIAH1（F=1.467、2.119，P＜0.05）與Hrk（F=8.965、4.379，P＜0.05）的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

2.4 過表達(dá)SIAH1可通過上調(diào)Hrk的表達(dá)來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡 采用Western blot和RT-PCR驗(yàn)證Hrk siRNA的干擾效果，結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hrk siRNA 48 h后，與未處理組和control siRNA組相比，轉(zhuǎn)染Hrk siRNA后，MCF-7細(xì)胞中Hrk蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯減少（F=5.384、6.215，P＜0.05），證明Hrk siRNA是有效的。見圖4。為了檢測SIAH1與Hrk對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，運(yùn)用Annexin VFITC/PI試劑盒及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1后細(xì)胞凋亡率（29.02%±3.31%）明顯高于未處理組（2.69%±0.35%）、pcDNA3組（3.09%±0.52%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=180.517、179.314，P＜0.05）。MCF-7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1和Hrk siRNA（4.40%±0.61%）后，細(xì)胞凋亡率明顯低于MCF-7細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3-myc-SIAH1組（29.02%±3.31%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187.369，P＜0.05），而與control siRNA組（3.47%±0.11%）、Hrk siRNA組（1.10%±0.50%）比，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.461、24.537，P＞0.05）。結(jié)果表明，過表達(dá)SIAH1可通過上調(diào)Hrk表達(dá)來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡。見圖5。

3 討論

圖2 SIAH1與Hrk在MCF-10A和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 轉(zhuǎn)染SIAH1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-myc-SIAH1后SIAH1與Hrk的表達(dá)

SIAH1是重要的蛋白泛素化和蛋白水解酶，在調(diào)控蛋白降解中發(fā)揮重要作用。SIAH1在腫瘤中更是一種重要的腫瘤抑制因子。有研究報(bào)道，SIAH1在肝癌中表達(dá)缺失或表達(dá)下調(diào)，SIAH1可抑制肝癌的發(fā)生[11]。上調(diào)SIAH1表達(dá)可通過p38 MAPK激活p53通路來誘導(dǎo)神經(jīng)脊細(xì)胞凋亡[12]。BRUZZONIGIOVANELLI等[13]報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SIAH1表達(dá)質(zhì)粒后，可通過改變有絲分裂和誘導(dǎo)p21Waf-1/Cip-1的表達(dá)來抑制細(xì)胞的生長。另有研究發(fā)現(xiàn)[14]SIAH1可通過作用于p53與p21來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤形成。

圖4 干擾Hrk表達(dá)可下調(diào)Hrk mRNA與蛋白表達(dá)

Bcl-2家族是目前比較公認(rèn)的凋亡相關(guān)蛋白家族，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其包括3個(gè)亞家族，分別是：Bcl-2亞家族、Bax亞家族及BH3亞家族（又稱BH3-only蛋白）。其中，BH3亞家族成員包括Bik、Blk、Bid、Bad、Bim、Hrk、Puma等。已有研究表明，BH3亞家族成員均可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，起到腫瘤抑制因子的作用[15]?，F(xiàn)已明確，Bim在某些促凋亡因子的刺激下被激活，活化的Bim分子可通過與Bcl-2/Bax結(jié)合從而激活Bax，最終通過線粒體途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡[16]。我們以往研究發(fā)現(xiàn)SIAH1和Bim蛋白在乳腺正常組織、不典型增生組織、導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)逐漸降低，且與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的高分化和低臨床分期呈正相關(guān)，且SIAH1與Bim表達(dá)也呈正相關(guān)[7]。有研究報(bào)道Hrk基因是MAPK/JNK/c-jun作用的靶基因[17]。激活MAPK/JNK后可以上調(diào)Hrk表達(dá)來促進(jìn)胰腺β-細(xì)胞凋亡[18]。Bim與Hrk同屬BH3-only亞家族蛋白，均發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，在乳腺癌中SIAH1是否也與Hrk蛋白表達(dá)相關(guān)，是否也可通過上調(diào)Hrk蛋白表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡并不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，SIAH1與Hrk蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且均與乳腺癌的高病理分級(jí)和低臨床分期呈正相關(guān)。SIAH1與Hrk在乳腺癌組織中表達(dá)低于配對(duì)的癌旁組織。SIAH1與Hrk在乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A中表達(dá)高于乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。為了明確SIAH1與Hrk的相互關(guān)系，我們瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了SIAH1表達(dá)質(zhì)粒，鑒于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的不穩(wěn)定性，我們分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h、48 h及60 h后收集細(xì)胞，無論是轉(zhuǎn)染SIAH1表達(dá)質(zhì)粒還是干擾片段，發(fā)現(xiàn)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染效率最高，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞。與未處理組及對(duì)照質(zhì)粒組相比較，過表達(dá)SIAH1可上調(diào)Hrk的表達(dá)。為了進(jìn)一步明確Hrk是否也在SIAH1調(diào)控的乳腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，我們共轉(zhuǎn)染了SIAH1表達(dá)質(zhì)粒和Hrk siRNA，結(jié)果表明與單獨(dú)轉(zhuǎn)染SIAH1表達(dá)質(zhì)粒相比，共轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞凋亡率顯著下調(diào)。這些結(jié)果提示Hrk同樣也參與了SIAH1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SIAH1與Hrk在乳腺癌中表達(dá)低于正常乳腺組織，其表達(dá)與乳腺癌高病理分級(jí)和低臨床分期呈正相關(guān)。SIAH1可通過調(diào)控Hrk表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，SIAH1與Hrk在抑制乳腺癌形成中發(fā)揮重要作用。