miR-1和miR-369在中外豬種背最長肌中的表達與肉質性狀的關系研究

楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，鐘志君，呂學斌

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

miRNA是一類內生的、長度約為20～22個核苷酸，通過結合到靶mRNA上參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA，其在基因表達調控、脂肪細胞分化、脂質代謝等生理過程中均發揮著重要的作用[1-3]。先前研究顯示miR-1可通過HDAC4作為靶基因促進肌發生，對調節骨骼肌增殖與分化起了非常重要的作用[4]，它會與轉錄因子結合，促進心肌細胞膨脹，從而抑制心肌細胞的增殖；miR-369通過招募AGO2和FXR1蛋白復合體結合到腫瘤壞死抑制因子-α基因3′UTR區域的腺嘌呤/尿嘧啶富集元件上靶向調控TNF-α的表達[5]，TNF-α與豬肉品質存在顯著相關。

鑒于這兩種miRNA與豬肉品質調控存在的關系，研究采用Q-PCR技術對四川省4個地方豬種和約克夏背最長肌組織中miR-1和miR-369的表達與肉質性狀的差異進行了研究。該研究將為進一步探明不同豬種肉質差異形成的分子機制提供基礎數據，并為培育優質高效的新品種/配套系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣本采集

該試驗于2015年12月在四川省畜牧科學研究院種豬科研基地進行。每個豬種隨機選取6頭，共計30頭，所有試驗豬只于同一時間開始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營養水平和飼喂方式，達到9月齡時進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數3～4肋骨間對應處的背最長肌組織，用于后續的肉質相關表型指標測定和miRNA熒光定量檢測。

1.2 肌內脂肪含量（IMF）測定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自動快速抽提儀進行抽提，程序設置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個樣本獨立測定兩次。樣品處理和試驗操作嚴格按照國標GB/T 9695.1—2008《肉與肉制品游離脂肪含量測定》進行。

1.3 肌纖維直徑測定

采用KD-2508型切片機（Kedee,China）制作背最長肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統（Optec,China）采集代表性區域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測定每個樣品的肌纖維面積。

1.4 硫胺素含量測定

樣本處理和試驗方法參照國家標準GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素 B1）的測定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測定

測量左胴體倒數3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計算眼肌面積。按豬胴體性狀測定技術規范（NY/T 825—2004）方法測定并計算瘦肉率。

1.6 miR-1和miR-369含量的測定

引物信息見表1。所有目的miRNA定量結果均通過溶解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每個樣本重復3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

表1 引物信息

1.7 統計方法

試驗數據采用Sigmaplot 12.0對性狀指標和基因表達量進行ANOVA分析，相關性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結果與分析

2.1 相關肉質指標含量

由表2可知，在5個豬種中，藏豬肌內脂肪含量最高（5.62%），其次為雅南豬（5.09%），約克夏豬最低（2.06%），地方豬種極顯著高于外種豬（P＜0.01）。在4個地方豬種中，藏豬、雅南豬和內江豬的肌內脂肪含量極顯著高于成華豬（P＜0.01）；藏豬肌纖維直徑最小（68.12 μm），顯著小于其它3個地方豬種（P＜0.05），約克夏肌纖維直徑最大（92.74 μm），極顯著大于 4個地方豬種（P＜0.01）；4個地方豬種的眼肌面積在14～22 cm2之間，藏豬和成華豬的眼肌面積顯著低于雅南豬、內江豬（P＜0.05），約克夏豬的眼肌面積極顯著高于4個地方豬種（P＜0.01）；藏豬的瘦肉率最低（42.74%），約克夏豬的瘦肉率最高（63.54%），4個地方豬種瘦肉率之間差異不顯著，約克夏豬極顯著高于4個地方豬種（P＜0.01）；雅南豬的硫胺素含量最高，為 2.84 μg/g，其次是藏豬（2.18 μg/g），內江豬硫胺素含量最低，為1.06 μg/g，其次為約克夏豬（1.21 μg/g），顯著低于其它3個豬種（P＜0.05），藏豬、成華豬和雅南豬無顯著差異。

表2 不同豬種相關肉質指標含量（n=6）

2.2 2種相關miRNA的表達水平

采用Q-PCR的方法，檢測了miR-369和miR-1在豬背最長肌中的相對表達量，其結果見表3。由表3可知，成華豬的miR-369的相對表達量最高，其次為雅南豬，最低的為內江豬，內江豬的miR-369的相對表達量極顯著低于其它4個豬種（P＜0.01），約克夏豬的miR-369的相對表達量顯著低于藏豬、成華豬和雅南豬（P＜0.05）；藏豬miR-1的相對表達量最高，其次為成華豬，最低的為內江豬和約克夏豬，藏豬、成華豬和雅南豬的miR-1相對表達量極顯著高于內江豬和約克夏豬（P＜0.01）。

表3 不同豬種的miR-369、miR-1水平（n=6）

2.3 2種miRNA的表達水平與肉質相關指標含量的相關性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉質性狀相關指標和基因表達量的相關性，由表4可知，miR-369、miR-1在背最長肌中的表達水平與肌內脂肪含量和硫胺素含量呈正相關（r肌內脂肪含量=0.5～0.7；r硫胺素=0.6~0.9），其中miR-369與硫胺素呈顯著正相關（r=0.85，P<0.05）；miR-369、miR-1 在背最長肌中的表達水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負相關（r肌纖維直徑=-0.1～-0.6；r眼肌面積=-0.3～-0.9；r瘦肉率=-0.3～-0.8），其中miR-1與眼肌面積呈顯著負相關（r=-0.89，P<0.05）。

表4 miR-369、miR-1與肉質相關指標的相關性分析（n=6）

3 討論

提供滿足消費者需求的豬肉產品具有重要意義，近年來育種學家已在豬肉質的調控機理方面做了大量研究[6-8]，然而這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發現和功能研究的深入，從轉錄后的miRNA水平探索豬肉質差異形成的分子機理成為了研究的熱點。影響豬肉質風味的因素很多，其中肌內脂肪含量是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風味密切相關[9]，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在5個豬種中，4個地方豬種的肌內脂肪含量在3.72%～5.62%之間，肉質優良，約克夏豬的肌內脂肪含量2.06%，極顯著低于地方豬種；肌纖維直徑越細，肉質就越細嫩，味美。研究顯示4個地方豬種的肌纖維直徑在60～80 μm之間，肉質細嫩，約克夏豬肌纖維直徑為92.74 μm，極顯著高于4個地方豬種；胴體瘦肉率是評價胴體品質的主要指標，與眼肌面積呈極顯著正相關，與肌內脂肪含量呈負相關，4個地方豬種的胴體瘦肉率在42%～50%之間，屬脂肪型豬種，約克夏豬達63.54%，極顯著高于地方豬種；硫胺素是一種非常重要的風味前體物質，其熱降解是食品加工過程中風味形成的主要途徑之一[10]，研究顯示藏豬、成華豬、雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高，風味更好。由本研究可知，地方豬種均屬于肉質優良豬種，其風味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為優質風味豬培育的育種素材。

miRNA對豬肌肉發育有著重要的調節作用[4]，Chen等[11]2006年研究發現miR-1在骨骼肌細胞分化成熟過程中呈現一定的時空特異性表達，促進骨骼肌細胞分化。miR-369靶向調控TNF-α的表達，在脂肪沉積過程中扮演著重要角色[5]。本研究采用熒光定量PCR技術對藏豬、成華豬、雅南豬、內江豬和約克夏豬背最長肌組織中miR-1和miR-369差異表達進行了研究。結果顯示背最長肌組織中2個miRNA的表達水平在5個豬種中趨于一致。相關性分析顯示，2種miRNA在背最長肌中的表達水平與肌內脂肪含量和硫胺素含量呈正相關，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負相關，表明miR-1和miR-369對豬肉質具有正調控作用，而對豬胴體性能具有負調控作用，其可以影響豬肌肉生長和脂肪沉積，為通過調控其表達水平實現對豬肉質風味的改善提供了可能。

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