川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬大腸桿菌血清型調查及耐藥性檢測

王潤錦，陳 羲，馬金英

（1.西藏自治區山南市畜牧獸醫總站，西藏 山南 856100；2.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，是人和動物腸道共生菌，可以作為社區和農場中各種細菌耐藥性發生情況的指標菌，而藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區和藏東三江流域中游海拔為3 500 m左右的氣候條件惡劣的高原地帶，是我國唯一的高原豬種[1-2]。藏豬具有肉質優良、耐嚴寒、耐粗飼、抗逆性強等優點。但隨著川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬養殖業的發展，藏豬養殖初具規模化，一些傳染性疾病也日漸嚴重，給養豬業造成不小經濟損失。對藏豬源大腸桿菌和腸球菌開展耐藥性調查及其耐藥機制研究，在獸醫及人醫領域均有重要的公共衛生意義[3]。筆者于2016年8月對拉薩-林芝公路沿線12個鄉鎮藏豬采集直腸棉拭子共計1 200份，分離出了大腸桿菌，在此基礎上進一步做了菌株分離及耐藥性的檢測，結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉、章多鄉、甲瑪鄉、工卡鎮、扎西崗鄉、日多鄉、加興鄉、金達鎮、巴河鎮、百巴鎮、更章門巴民族鄉、八一鎮為采樣點，采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份，保存于1 mL營養肉湯的滅菌醫用配離心管，車載冰箱4℃保存。標明樣品采集時間、地點、編號。

采樣原則：每個采樣點分別采集1歲以上藏豬直腸棉拭子40頭份、斷奶仔藏豬60頭份。

1.1.2 標準菌株 大腸桿菌（ATCC25922）購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 細菌培養基及配制 普通營養肉湯培養基購于廣東環凱微生物科技有限公司。稱取營養肉湯粉末18 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min，待冷至常溫，備用。

麥康凱瓊脂培養基購于廣東環凱微生物科技有限公司。稱取麥康凱瓊脂粉末55 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min。待培養基冷至50～55℃傾注滅菌平皿，待凝固后，備用。

科瑪嘉?大腸桿菌顯色培養基（ECC）購于博賽生物技術股份有限公司。取瓶內干粉37.3 g溶于1 000 mL去離子水的潔凈三角瓶中，充分攪拌混勻，高壓滅菌（121℃，15 min）。加熱后的培養基冷卻至45～50℃，輕輕地搖動均勻，傾注平皿，使其凝固，晾干備用。

伊紅美蘭瓊脂培養基（EMB）購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司。稱取伊紅美蘭瓊脂培養基粉末42.5 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

LB營養瓊脂培養基平板購于上海凡儀科技發展有限公司。

1.1.4 大腸桿菌API-20E生化鑒定試紙條 生化反應鑒定試紙條API-20E購于法國梅里埃生物技術有限公司，用于腸桿菌屬細菌的快速生化鑒定。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離和初步鑒定 用無菌接種環蘸取少量被檢藏豬直腸棉拭子的營養肉湯，劃線接種在麥康凱瓊脂平板上，37℃恒溫培養16～18 h，挑取紅色或粉紅色的單菌落（每個樣本挑取一個），在LB肉湯中37℃培養18 h左右，取菌液劃線接種于ECC顯色培養基，在37℃培養18～24 h，觀察菌落形態，呈現光滑、邊緣整齊、直徑為1～2 mm的藍色或綠色圓形菌落可初步判斷為大腸桿菌[4]。

1.2.2 大腸桿菌API-20E試紙條的生化鑒定 將少量可疑細菌接種于API-20E試紙條，培養20 h左右，加入相應顯色試劑后觀察其顏色的變化，根據說明表判讀反應，參照分析圖索引和APLAB PLus軟件得到鑒定結果。

1.2.3 致病性試驗 將生化反應特征符合大腸桿菌的菌株接種營養肉湯，37℃培養18 h后，分別腹腔接種小白鼠，0.2 mL/只，觀察存活情況。剖檢死亡小白鼠，取其臟器用伊紅美蘭培養基進行種菌回收試驗，其培養特性、形態、染色反應均符合大腸桿菌，判定為致病性大腸桿菌[3，5]。

1.2.4 大腸桿菌O抗原血清型鑒定 將經分離鑒定為致病性大腸桿菌的菌株接種于普通瓊脂培養基上，進行純培養，用少量0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌落，制成濃稠菌懸液，121℃高壓滅菌2 h，破壞K抗原，冷卻后用微量移液器吸取25 μL與等量標準血清進行玻片凝集試驗，5 min內出現明顯凝集者為陽性反應，同時以生理鹽水作對照，觀察有無自凝現象[5-6]。

1.3 藥敏試驗

青霉素、慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林、卡那霉素、環丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素9種藥，按照常規藥敏紙片擴散法進行操作，并根據抑菌圈直徑（Ф）判定藥物敏感性，Ф≥20 mm為高度敏感，15 mm≤Ф＜20 mm為中度敏感，Ф＜15 mm為耐藥。

2 結果

2.1 分離菌株鑒定結果

從拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉、章多鄉、甲瑪鄉、工卡鎮、扎西崗鄉、日多鄉、加興鄉、金達鎮、巴河鎮、百巴鎮、更章門巴民族鄉、八一鎮采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份的樣品中，共分離鑒定出99株致病大腸桿菌菌株。其培養特性及染色、生化反應特征為：革蘭氏染色均為革蘭氏陰性桿菌；在普通肉湯中呈均勻混濁，液面有菌膜，管底有白色沉淀，振蕩呈云霧狀散開；普通瓊脂平板上生長呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的圓形菌落，直徑1～3 mm；麥康凱培養基上生長呈粉紅色菌落；ECC培養呈藍色；伊紅美蘭培養基上生長呈紫黑色帶金屬光澤菌落；API-20E試紙條的生化鑒定為大腸桿菌。

2.2 菌株血清型鑒定結果

用50種O抗原血清對99株分離株進行血清型鑒定，除14株未鑒定出血清型外，其余85株血清型 分 屬 于 O21（15/85）、O9（12/85）、O101（9/85）、O18（9/85）、O85（9/85）等22個血清型（表1）。其中O21、O101、O18、O9、O85有54株，共占所鑒定分離菌株的63.53%（54/85），這幾種血清型均為拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。

表1 豬大腸桿菌分離菌株血清型鑒定結果

2.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果發現，拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉、章多鄉、甲瑪鄉、工卡鎮、扎西崗鄉、日多鄉、加興鄉、金達鎮、巴河鎮、百巴鎮、更章門巴民族鄉、八一鎮不同鄉鎮分離獲得的藏豬大腸桿菌致病菌株對藥物的敏感性差異較小。對卡那霉素、環丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素4種藥高度敏感，對慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林中度敏感，對青霉素耐藥。其中77.13%的菌株對青霉素耐藥，對慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林耐藥的菌株分別為19.47%、18.10%、17.77%和15.39%。

3 討論

大腸桿菌引起的仔豬下痢仍然是導致藏豬養殖業經濟效益較差的重要原因之一，長期困擾著藏豬養殖業的發展。在當地獸醫指導下，經藥物治療后雖然仔豬死亡率不高，但常引起發病仔豬生長發育遲緩、生產能力低下，給拉薩-林芝公路沿線藏豬養殖業造成嚴重的經濟損失。

77.13%的菌株對青霉素耐藥，說明拉薩-林芝公路沿線藏農牧民經常盲目給發病豬使用青霉素，致使大腸桿菌產生耐藥。對發病藏豬，在確診的基礎上，與相關教學科研單位協作，通過藥敏試驗，有目的、有針對性地用藥，且用藥應有足夠療程和劑量，盡量減少耐藥菌株產生[5，7]。

選擇適合本地血清型的大腸桿菌疫苗，方能有效預防本病發生。在血清型鑒定中發現，O21、O101、O18、O9、O85有 54株，共占所鑒定分離菌株的 63.53%（54/85），即這幾種血清型是拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。不同區域流行菌株血清型差異較大，而且同一藏豬養殖較為集中的鄉鎮也存在多種血清型，因此，在大腸桿菌的免疫預防中，應充分考慮其血清型的多樣性、易變性[7]，尤其是藏豬養殖較為集中的鄉鎮最好每年進行一次血清分型鑒定，以便有針對性地進行免疫。

[1]強巴央宗，謝莊，田發益.高原藏豬現狀與保種策略[J].中國畜牧雜志，2001，37（6）：46-47.

[2]唐建華，馮靜，陳曉英，等.藏豬種質資源保護與利用研究[J].養豬，2016（1）：68-70.

[3]陳溥言.獸醫傳染病學[M].第6版.北京：中國農業出版社，2016：108-117.

[4]李鵬.藏豬源大腸桿菌和腸球菌耐藥性調查及其耐藥機制的研究[D].北京：中國農業大學，2015.

[5]謝永平，楊威，陳澤祥，等.廣西地區豬大腸桿菌血清型調查及耐藥性檢測[J].廣西農業科學，2010，41（4）：380-382.

[6]陸承平.獸醫微生物學[M].第5版.北京：中國農業出版社，2013：78-86.

[7]嚴亮.大腸桿菌多重耐藥株的體外誘導初步研究[J].畜牧與飼料科學，2015，36（4）：15-17.