微波輔助提取黑豆皮花青素的工藝優化

袁園 張瀟 張凱 楊剛

摘要：以酸性乙醇為提取劑，采用微波輔助法提取黑豆皮中的青花素，先研究了提取液的pH值、乙醇濃度、溫度、料液比、時間等單因素實驗的影響，再在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗，篩選出了在各因素共同作用下的最佳提取工藝。最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1：40，提取溫度為70℃，時間為8min。測得花青素含量為4. 887 mg/g黑豆皮。該提取工藝穩定可行，可為黑豆花青素的提取提供參考。

關鍵詞：黑豆;花青素;微波提取;正交實驗

中圖分類號：TS202.3

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）2-0171-03

1 引言

黑豆（ Black Soybean），豆科植物，又稱黑大豆、烏豆等，原產于中國。黑豆富含蛋白質、氨基酸、脂肪、維生素等多種營養成分，并且有活血、利水、祛風、清熱解毒、滋養健血、補虛烏發的功能。花青素是黑豆皮色素的主要成分之一，是一種非常好的抗氧化劑，具有多種生理活性功能。黑豆皮花青素作為一種天然色素，在酸性條件下穩定，天然無毒，是一種安全的、健康的食品添加劑[1，2]。

微波輔助技術具有設備簡單、提取效果好、時間短、效率高的優點，微波輻射容易破壞細胞，從而使有效成分在短時間內從細胞內溶出。目前，微波輔助法已經是提取植物中有效成分的熱點，已運用于提取多種植物的有效成分，但利用微波輔助法對黑豆中花青素的提取工藝的研究卻鮮有報道。因而本實驗利用微波輔助法提取黑豆中的花青素，以原花青素含量為指標，在pH值、乙醇濃度、溫度、料液比、時間5個單因素實驗的基礎上，通過正交實驗確定黑豆中花青素的最佳提取條件。

我國黑豆資源豐富，以黑豆為原料，開發利用花青素及相關產品具有便利的條件，以期為黑豆中花青素的工業化提取提供參考，也為進一步研究花青素的生物學活性及在保健食品和食品添加劑的應用提供一定的理論依據[3，4]。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

黑豆皮，安國市御顏坊中藥材有限公司;原花青素標準品，上海金穗生物科技有限公司，乙醇，鹽酸，甲醇，香草醛，均為分析純。

2.2 儀器與設備

Cary 60紫外分光光度計，美國安捷倫儀器有限公司產品;AL104電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產品;PHSJ-3F型實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司;SHZⅢ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;MAS-3微波萃取器，上海新儀微波化學科技有限公司。

2.3 溶液的配制

2.3.1 標準品的配制

精密稱取0. 1000 g的原花青素標準品，用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的標準品水溶液。

2.3.2 顯色劑的配制

（1）香草醛 甲醇溶液。準確稱取1.000 g香草醛，用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液。

（2）鹽酸甲醇溶液。用移液管量取15. 00 mL濃鹽酸，用甲醇稀釋定容至100 mL，配制成15%（V/V）的鹽酸 甲醇溶液。

（3）顯色劑。1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液：15%（ V/V）的鹽酸甲醇溶液=1：1。

2.4 方法

2.4.1 黑豆皮中花青素的提取工藝

黑豆皮干燥到恒重，粉碎一過60目篩一準確稱取1g一加入一定酸度的乙醇溶液一微波提取2次一抽濾一合并提取液一加入提取液定容至50 mL- 530 nm[5，6]處測吸光度。

2.4.2 標準曲線的繪制

分別精確吸取2、4、6、8、10 mL已配置好的標準品溶液至100 mL容量瓶中，加入一定量的顯色劑，并用1%的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，在530 nm下，以蒸餾水作為參比，測定吸光度，繪制標準曲線。以香草醛的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，并作回歸處理，得回歸方程y =O.0711X+O. 0051，r=0.9991。

2.4.3 黑豆皮中花青素的測定

用移液管精準吸取1 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用相應浸提液稀釋至刻度，以蒸餾水作參比在波長530 nm處測定吸光度，根據標準曲線算出花青素提取液的濃度，按照以下公式計算黑豆皮中的花青素的質量。

黑豆皮中的花青素的質量m=cVK

其中，c為測量液中花青素的濃度（μg/mL）;V為提取液體積（mL）;K為提取液稀釋的倍數。

2.4.4 單因素實驗

以預處理過的黑豆皮粉為原料，利用微波提取法，以香草醛含量為指標，經單因素實驗初步考察提取液的pH值、乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間5個因素對黑豆皮中花青素的質量的影響。

用2 mol/L的HC1調節50%的乙醇溶液的pH值分別為0.5、1.O、1.5、2.O、2.5、3.O，料液比1：25 （g/mL），設置儀器參數為60℃，10 min，300 r/min，研究提取液的pH值對花青素含量的影響。

分別以pH =1的體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為提取劑，料液比1：25（ g/mL），設置儀器參數60℃，10 min，300 r/min，研究乙醇濃度對花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，料液比1：25（ g/mL），時間分別為5、6、7、8、9、10 min，60℃，300r/min，研究提取時間對花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，料液比1：25（ g/mL），300 r/min，8 min，分別設置溫度至40、50、60、70、80c，研究提取溫度對花青素含量的影響。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取劑，以料液比1：30、1： 40、1： 50、1： 60、1：70（ g/mL），微波處理8min，60℃，300 r/min，研究料液比對花青素含量的影響。

2.4.5 正交實驗

根據單因素實驗結果，選取微波提取溫度、提取時間、乙醇體積分數、料液比為實驗因素，采用正交表L9（34）進行正交實驗，以波長530 nm處的吸光度為考察指標，確定黑豆皮青花素的最佳提取條件。

3 結果與分析

3.1 浸提液pH值對花青素提取效果的影響

花青素在酸性條件下較為穩定，因此浸提液pH值對青花素的提取影響較大，在實驗中提取液顏色為酒紅色，測得其吸光度情況見圖1所示。

從圖1中可以看出，色素的吸光度隨pH值的增大，呈現先增大后建校的趨勢，可能是色素結構發生改變的緣故。由圖可知，在pH=l時，吸光度最大，提取效果最好，因而確定浸提液的pH值為1.O。

3.2 乙醇濃度對花青素提取效果的影響

花青素易溶于水、甲醇、乙醇、稀酸、稀堿中，考慮了溶劑的特性，出于綠色化學的角度，選用了乙醇的水溶液作為提取劑，不同體積分數的乙醇對花青素提取效果的影響如圖2。

從圖2中可以看出，在乙醇濃度為70%是的提取效果最好，濃度繼續上升時，吸光度反而減小，這是由于乙醇濃度太大，溶液的極性減小，黑豆皮中花青素的溶解度降低，且更多的醇溶性雜質被溶出。因而在此次實驗中，確定提取液的乙醇濃度為70%。

3.3 提取時間對花青素提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，青花素的濃度也隨之增加，到8 min時達到頂點，然后下降。分子在微波場的作用下能產生瞬時極化并迅速生成大量的熱能，促使細胞破裂，使細胞液溢出并擴散至溶劑中。時間過長，可能會破壞提取液中的有效成分。在此次實驗中，提取時間確定為8 min。

3.4 提取溫度對青花素提取效果的影響

由圖4可知，花青素濃度隨著溫度的增加而增加，在60℃時最高，提取效果最好，再升高溫度，溫度隨之下降，這是由于隨著溫度升高，熱運動加速，花青素更易流出。但是在過高溫度的條件下，花青素的結構遭到破壞，降低提取效果，因此在提取過程中要避免溫度過高。

3.5 料液比對花青素提取效果的影響

由圖5可知，在料液比為1：40時提取效果最好，1：30時由于料液比太小，有效成分還未完全溶出就已達到飽和，而再增加料液比時，由于有效成分已完全溶出，溶劑增加，濃度變小。在此次實驗中，選取料液比為1： 40。

3.6 正交實驗

在考察了浸提液pH值、乙醇濃度、提取時間、提取溫度、轉速、料液比對黑豆皮青花素提取效果的基礎上，設計正交實驗對乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）等因素進行4因素3水平L9 （34）正交實驗，以優化其提取工藝（表1～3）。

從表2和表3可以看出乙醇濃度對黑豆皮花青素的提取效果有顯著的影響，其最佳提取工藝為A2 82 C2 D3，乙醇濃度為70%，8 min，料液比為1：40，提取溫度為70℃。影響提取黑豆皮青花素的各因素主次順序為A>C>D>B，即乙醇濃度>料液比>溫度>時間，乙醇濃度的影響最為顯著（P<0.05）。

3.7 花青素含量測定

精確稱取黑豆皮粉末lg，在最佳工藝條件下微波提取2次，抽濾后定容至100 mL，準確吸取2 mL提取液于25 mL容量瓶中，用浸提液稀釋到刻度，以蒸餾水作為參比，于530 nm處測定吸光度，由標準曲線求得青花素的含量。重復此實驗3次（表4）。

4 結論

以原花青素為指標，利用紫外分光光度法測定黑豆中花青素的含量，通過單因素及L9 （34）正交實驗，分析料液比、乙醇濃度、溫度、微波處理時間對黑豆皮中花青素含量影響，并優化最佳提取條件，經分析可知微波提取黑豆青花素的最佳工藝為乙醇濃度70%，料液比1：40，溫度為70℃，提取時間8 min。經計算，花青素的含量為4. 887 mg/g黑豆皮。微波輔助提取黑豆中花青素體現出了明顯的優勢，溫度低、時間短、效率高，可為黑豆中花青素的開發應用以及工業化生產提供理論依據。

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