有氧運動對慢性應激大鼠空間學習記憶及海馬齒狀回BDNF表達的影響

崔建梅+楊文艷+藥宏慧+于芳+薄媛媛+蘇曉云+龐立杰

摘 要：通過研究跑臺運動對慢性應激大鼠空間學習記憶能力及海馬齒狀回腦源性神經營養因子（BDNF）含量的改變，探討有氧運動改善慢性應激大鼠認知能力的可能機制。方法：將健康成年Sprague-Dawley（8周）大鼠隨機分為3組：正常對照組（C，n=10）、應激模型組（CUS，n=10）及應激運動組（CUS+E，n=10）3組，通過慢性不可預知應激建立大鼠抑郁模型。CUS+E組大鼠采取4周跑臺運動，通過八臂迷宮實驗觀察跑臺運動對應激大鼠學習記憶能力的影響；八臂迷宮實驗結束后用ABC免疫組織染色法檢測各組大鼠海馬齒狀回BDNF的分布。結果：與CUS組大鼠比較，CUS+ E組大鼠八臂迷宮實驗中大鼠完成八臂迷宮探索時間（P<0.05）及進入放餌料臂平均潛伏期均顯著縮短（P<0.05），參考記憶（P<0.05）及總記憶錯誤次數（P<0.05）均顯著增多；海馬DG區BDNF數量（P<0.05）及面積（P<0.05）均顯著增多。結論：當前研究發現4周跑臺運動可能通過激活海馬DG區BDNF通路，增強海馬DG區BDNF的表達，改善慢性應激大鼠的學習記憶能力。

關鍵詞：跑臺運動；學習記憶；海馬DG；腦源性神經營養因子

中圖分類號：G 804.2 學科代碼：040302 文獻標識碼：A

Abstract： Objective： To observe the effects of treadmill exercise on the learning， memory and Hippocampal DG （dentate gyrus） BDNF （brain derived neurotrophic factor） expression in CUS （chronic unpredictable mild stress） rats and explore the possible mechanism of regular aerobic exercise to improve learning and memory. Methods： 30 adult SD （Sprague-Dawley） male rats were randomly assigned into 3 groups： control group （C）， chronic unpredictable stress group rats （CUS） and stress exercise group （CUS+E）. All rats were subjected to CUS except the control group. The learning and memory ability of rats were tested by radial arm maze test （CUS） after CUS+E group rats received 4-week treadmill exercise. Subsequently， ABC immunohistochemical staining detected BDNF expression in Hippocampus DG in every group rats. Results： Compared with the CUS group rats， the time of completing 8-arms radial maze and latency of entering into bait arms in ERM test significantly shortened （P<0.05， P<0.05）， reference memory errors and total memory errors in RAM test significantly decreased（P<0.05， P<0.05）； number and area of BDNF significantly increased in Hippocampal DG （P<0.05， P<0.05） in CUE+E group rats. Conclusion： The present experiment verified that 4-week treadmill exercise reverses stress-induced learning and memory impaired via an increase in BDNF signaling and may increase BDNF expression in Hippocampal DG.

Keywords： treadmill exercise； learning and memory； Hippocampal DG； BDNF

抑郁癥是一種慢性、復發和潛在的威脅人類生命的情緒障礙性疾病。全世界抑郁發病率可能為17%[1]。盡管抑郁癥是全球致殘的主要病因，但其病理生理學機制仍不清楚。實驗表明，認知障礙如學習記憶障礙是抑郁癥的核心癥狀[2]。壓力，尤其是長期反復接觸的應激壓力，會對行為和生理反應產生不良影響，也是抑郁癥發病的主要原因之一；因此，慢性不可預知的應激壓力（chronic unpredictable mild stress，CUS）模型已經被廣泛地應用于模仿慢性抑郁癥的病理發展及評估抗抑郁藥的功效。研究認為，應激會導致一系列的生理、生化和大腦行為的改變，之前有研究表明長期慢性應激會通過增加糖皮質激素的分泌損害神經可塑性、學習和記憶過程[3]。許多動物實驗表明，慢性應激可引起大鼠抑郁樣行為改變，例如動物體質量下降、探索活動減少及減少對獎賞刺激的反應[3]，并且通過水迷宮及八臂迷宮證實，慢性應激暴露還可削弱大鼠的認知過程[4-5]。

在中樞神經系統中，海馬是涉及重復或慢性應激引起神經可塑性異常的大腦區域之一，這些異常包括海馬萎縮、神經發生減少及突觸可塑性受損。海馬齒狀回（Hippocampal dentate gyrus，DG）對應激激素糖皮質激素尤其敏感，可以調節HPA軸的功能[6]，并且新近研究發現，海馬DG神經元在提高或保持學習記憶能力方面扮演重要的角色，與學習記憶密切相關[7]。腦神經神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神經生長因子家族的一員，在海馬及前額葉皮質分布最為廣泛，可以調節腦神經元的生存、突觸傳遞及突觸可塑性。多數學者認為BDNF的調節異常與抑郁癥的病理發展有關。Karege等發現，重癥抑郁病人血清BDNF水平下降，與抑郁評分量表得分呈負相關，并且與健康受試者的情緒障礙有關[8]。動物實驗證實，大鼠經過應激刺激后，大腦某些區域BDNF mRNA及BDNF蛋白均顯著減少[9]，并且有學者證實慢性抗抑郁藥物治療與BDNF信號通路有關，可以提高BDNF的合成。endprint

研究認為，體育鍛煉可以預防大腦細胞的老化、死亡、功能障礙及神經退行性疾病。此外，研究發現長期體育鍛煉可以改善情緒及認知障礙[10]。雖然體育鍛煉改善認知功能的確切機制仍有待闡明，但是多數學者認為運動對依賴海馬的學習記憶的影響可能與海馬神經發生、突觸可塑性和神經營養因子，尤其是腦源性神經營養因子BDNF等有關。跑臺運動的特征是讓動物每天在有限的時間內運動，更類似于人的體育鍛練。Aguiar等[11]研究表明，3～12周的跑臺運動可以糾正應激對機體的不良影響及增強應激大鼠的學習記憶能力。本課題組的前期研究發現，長期跑臺運動改善慢性應激大鼠學習記憶能力及海馬CA1與CA3區BDNF的表達，但是運動對應激大鼠海馬DG區BDNF的表達尚無相關研究；因此，本實驗采取4周中等強度跑臺運動，通過制備大鼠不可預知慢性應激模型（chronic unpredictable mild stress，CUS），探討4周中等強度跑臺運動改善CUS大鼠學習記憶能力是否與海馬DG區BDNF的表達水平變化有關。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

30只雄性健康8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠體質量200～220 g，飼養于中北大學動物飼養室（鼠籠規格：50 cm×26 cm×25 cm），濕度45%～65%，室溫20 ～24 ℃，光照周期為12 h光照/12 h黑暗（晝夜顛倒除外），實驗過程中大鼠可自由獲得食物及飲水（除了必要的應激程序）。30只大鼠隨機分為正常對照組C（control group，n=10）、應激模型組CUS（chronic stress group，n=10）及應激運動組CUS+E（chronic stress group treated with exercise group，n=10）3組，所有大鼠均單籠飼養。

1.2 CUS模型制備[12]

CUS組及CUS+E組大鼠從第2周開始每天上午（09：00—12：00）接受不可預知應激4周，根據以前學者描述的方法稍作修改，應激刺激包括7種溫和刺激。為了使應激程序不可預知，每周隨機安排7種應激程序順序，見表1。

1.3 跑臺訓練安排

大鼠適應環境1周后，從第2周開始每天下午CUS+E組大鼠進行跑臺訓練（0坡度）4周[13]，見表2。

1.4 八臂迷宮測試

八臂迷宮實驗[14]是評估動物學習記憶能力的常用模型之一，由八臂（每個臂：長41.9 cm，寬11.4 cm，高10.1 cm）組成；迷宮中央有一直徑為27.4 cm的八角形區域。正式實驗前，大鼠被放在迷宮中央八角形區域探索適應2 d（2次/d），八臂中距離2、4、6、8號臂末端1 cm處放置食物顆粒，允許其自由探索迷宮攝取臂中食物顆粒10 min。

正式實驗前所有大鼠被限制飲食2 d，實驗時按上述訓練順序4臂各放一顆餌料，關閉各臂門，將動物放在迷宮中央；15 s后將各臂門打開，讓動物在迷宮中自由選擇進入8臂中任何一臂攝取餌料（時間10 min）。測試指標：大鼠進入放食物臂潛伏期（s）、大鼠再次進入已經吃過餌料的臂為工作記憶錯誤次數（次）、動物進入不曾放餌料的臂為參考記憶錯誤（次）、總的錯誤次數（工作記憶錯誤次數+參考記憶錯誤次數）、測試時間與吃完所有餌料所花的時間（s），如果10 min餌料未吃完記為10 min。

1.5 海馬組織取材及海馬DG區BDNF免疫化學染色

學習記憶行為學測試結束后，大鼠被麻醉后（戊巴比妥鈉，40 mg/kg）仰臥在手術臺上，

手術剪開大鼠胸腔暴露心臟，灌胃針經心尖穿入主動脈，右心耳被剪開，快速灌入生理鹽水（4 ℃）300 mL，隨后先快后慢灌入4%的、PH7.4的4 ℃多聚甲醛150 mL，灌注結束后迅速用鑷子開顱取腦，移至蔗糖溶液（4 ℃、30%）脫水。70%酒精30 min 1次、90%酒精30 min 2次及96% 酒精15 min 2次進行酒精梯度脫水，石蠟包埋后取冠狀切面切片（片厚5 μm），進行BDNF免疫組織化學染色。為消除內源性過氧化物酶的活性雙氧水（0.3箛）室溫孵育30 min，于修復液中修復抗原，PBS 液沖洗3次×5 min，滴加BDNF一抗100 μL（1∶500），37 ℃恒溫箱孵育3 h，PBS液沖洗后加入二抗（生物素標記的山羊抗兔），37 ℃恒溫箱孵育30 min，加DAB 顯色液顯色12～15 min，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片。

1.6 海馬DG區BDNF圖像分析

每只大鼠選擇海馬DG區切片3張，每張切片隨機取 5 個不重疊（×400）視野觀察海馬DG區BDNF陽性細胞分布情況，用Olympus 顯微鏡采集圖像，形態學圖像分析系統對海馬DG區BDNF的表達進行半定量分析。用海馬DG區5個不同視野內BDNF免疫陽性細胞個數及面積的平均值表示每張切片BDNF的表達水平。

1.7 統計學方法

使用SPSS 18.0軟件，采用單因素方差分析法對學習記憶指標及海馬DG區BDNF表達進行組間差異比較，以P<0.05表示差異具有統計學意義。所有數據均采用平均數±標準差表示。

2 實驗結果

2.1 跑臺運動對CUS大鼠學習記憶能力的影響

與C組比較，CUS組大鼠進入放餌料臂平均潛伏期（96.67±34.56） s及完成八臂迷宮時間（281.30±144.62） s均顯著延長（P<0.01，P<0.01），參考記憶錯誤次數（5.00±2.86）及工作記憶錯誤次數（4.24±2.28）均顯著增加（P<0.05，P<0.01），總記憶錯誤次數（8.70±4.54）顯著高于C組（P<0.01）；與CUS組比較，CUS+E組大鼠進入放餌料臂平均潛伏期（67.56±21.48） s及完成八臂迷宮時間（175.20±58.61） s均顯著縮短（P<0.05，P<0.05），參考記憶錯誤次數（2.90±1.28）及總記憶錯誤次數（4.60±1.89）均顯著減少（P<0.05，P<0.05），工作記憶錯誤次數（3.86±1.68）與CUS組大鼠比較無統計學意義（P>0.05）。見表3和圖1所示。endprint

2.2 跑臺運動對CUS大鼠海馬DG區BDNF表達的影響

與C組比較，CUS組大鼠海馬DG區BDNF的表達顯著減少，數量（9.89±2.34）個及面積（1110.84±213.95） μm2均顯著下降（P<0.01，P<0.01），下降幅度分別為46.62%及45.94；經過4周跑臺運動與CUS組大鼠比較，CUS+E組大鼠海馬DG區BDNF的表達顯著增加，BDNF數量（P<0.05）及面積（P<0.05）均顯著增多，增加幅度分別為35.99%及20.16%。如圖2、圖3所示。

3 討論

眾所周知，應激對大腦及認知功能有很重要的調節作用，且應激與學習記憶及認知功能之間有很復雜的關系。研究表明，急性應激時與行為相關的大腦區域的神經元不會受損，并且可導致神經內分泌活動及中樞神經系統功能加強，而長期應激可產生一系列負面影響，神經功能會受到明顯影響，包括認知功能[15]。Uysal等[16]研究發現，通過水迷宮實驗證實大鼠經急性足底電擊（1.6 mA）20 min大鼠學習記憶能力顯著增強。臨床研究證實，長期或嚴重的慢性應激會影響成人的學習記憶及認知功能。許多動物實驗表明，CUS可引起動物出現類似于臨床抑郁癥的表現，例如蔗糖攝入量減少、體重增加、探索能力下降并減少獎勵刺激[17]，另外，CUS暴露可以影響認知過程，如學習記憶能力下降；因此，可以認為，應激對學習記憶產生正面或負面影響或許與應激的持續時間、應激程度及類型有關。本研究通過八臂迷宮實驗證實，經過28 d不可預知的應激，大鼠進入有食物的臂潛伏期延長，錯誤次數明顯增多，說明長期應激顯著削弱了大鼠的學習記憶能力，與前期學者研究一致。

多數研究表明，體育活動有益于大腦功能的神經保護，并且對在學習記憶過程中起重要作用的神經活動的變化、突觸結構及重要神經遞質的合成均有很重要的作用[18]。臨床研究認為，體育活動可以逆轉應激的有害影響，有效降低應激對機體的損害和改善抑郁患者的情緒障礙及認知功能[19]。Dimeo等[20]通過抑郁評分量表證實有氧鍛煉可以降低中度及重度抑郁病人的抑郁評分。動物實驗證實，慢性應激大鼠經過0坡度、速度8 m/min、每天30 min，連續6周的跑臺運動可顯著改善應激大鼠的學習記憶能力[21]。而Radahmadi等[22]發現規律的中等強度跑臺運動在預防及治療慢性應激引起的記憶障礙中均扮演重要角色。一些研究也表明，跑臺運動可以提高學習和記憶的速度，增強認知功能。Radak等[23]研究認為動物在跑步機上跑步更類似于人類的運動鍛煉，且最近的體外研究表明，中等強度跑臺運動不會引起作為應激標記的皮質酮水平的升高[24]。因此，本研究選擇的運動方式為中等強度跑臺運動，結果發現與CUS組大鼠比較，CUS+E大鼠經過4周中等強度跑臺運動八臂迷宮實驗中進入有食物臂的潛伏期及完成迷宮探索時間均顯著縮短，錯誤次數減少，提示跑臺運動可顯著改善CUS大鼠的學習記憶障礙，與上述學者研究結果一致。

研究認為，長期的應激刺激會通過改變海馬的形態和功能影響學習記憶能力，而McKinnon等研究發現重癥抑郁癥患者海馬體積減小；Kempermann等認為，成年人神經發生的特定區域在海馬DG區，而有學者認為重癥抑郁癥患者DG區神經形成的減少與海馬體積減小有關，并且抗抑郁藥物治療成功與否與神經形成的增多有關[25]。Travis等[26]研究表明海馬DG區體積的大小在重癥抑郁癥患者中起著關鍵作用，并且與抑郁癥患者認知功能的下降密切相關。因此，本實驗中我們聚焦于海馬DG區域。腦源性神經營養因子BDNF在大腦中廣泛分布，在海馬DG區有較高表達，與神經元的生存、突觸的生長及分化有關。Zhang等[27]研究表明海馬BDNF與海馬容量及記憶有關，易受各種精神疾病及慢性應激的影響。多數學者認為，應激刺激可以減弱海馬、前額葉皮質等大腦區域BDNF的表達，而抗抑郁治療可以增加這些區域BDNF的表達[28]。眾所周知，BDNF涉及長時程增強，增強突觸可塑性，與學習記憶的細胞機制有關。而抗抑郁藥物慢性治療可以明顯逆轉慢性應激導致的抑郁行為和認知參數的改變與海馬BDNF的表達上調有關；因此，可以推測本實驗中28 d CUS導致的大鼠學習記憶能力的下降與海馬DG區BDNF的表達下降有關。實驗表明，HPA軸功能紊亂與抑郁等情緒障礙有關，Liu等[29]認為慢性應激激活HPA軸導致皮質酮過度分泌在抑郁癥的發病機制及神經生物學方面起重要作用。本課題組的前期研究也已經證實，海馬是高濃度血漿皮質酮攻擊的主要靶區，并且與應激性海馬損傷過程有關，慢性應激時大量的皮質酮與海馬中糖皮質激素受體結合，導致海馬神經發生減少，突觸可塑性受損，損傷長時程增強，導致學習記憶能力下降；并且慢性應激引起的皮質酮持續增加可能會通過影響海馬腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性從而減少海馬BDNF表達[30]。Pesic等[31]認為，給予外源性皮質酮可顯著降低大鼠海馬BDNF的表達。因此，血清皮質酮水平升高可能是導致CUS大鼠海馬DG區BDNF表達下調的重要原因之一。

腦源性神經營養因子BDNF是運動對大腦是否有影響的重要調節因子。許多研究認為運動對中樞神經系統神經形成及認知功能改變與BDNF有關，并且BDNF對于有益于學習記憶的海馬突塑性的調節尤其重要，神經營養因子水平的增加會降低海馬神經元死亡和增強海馬突觸傳遞[32]。學者的前期研究表明，自愿或強迫的跑臺運動均可以增加內源性神經營養因子如BDNF的水平[33]。Fang等[34]認為，跑臺運動通過調節應激大鼠海馬BDNF通路改善應激大鼠的學習記憶能力。本研究也證實了上述觀點。研究表明，BDNF可以調節自由基代謝，增加谷胱甘肽氧化物酶（Gpx）及超氧化物歧化酶（SOD）等在神經元內的含量，對減輕神經元損傷起重要作用[35]。也有研究認為，BDNF可通過阻斷細胞凋亡蛋白激酶3抑制細胞凋亡防止大腦損傷，提高腦缺血大鼠空間學習和記憶功能[36]。本課題組前期研究已經證實，4周中等強度跑臺運動可顯著降低慢性應激大鼠的血清皮質酮水平；因此，可以推測本實驗中4周中等強度跑臺運動增強CUS大鼠學習記憶能力可能與拮抗HPA軸功能亢進，減少血清皮質酮分泌，上調CUS大鼠海馬DG區BDNF表達，從而增強海馬抗氧化能力及抑制細胞凋亡有關，具體機制需進一步研究。endprint

4 結論

本實驗結果顯示：長期慢性不可預知應激導致八臂迷宮實驗中大鼠空間學習記憶能力下降、海馬DG區BDNF表達減弱，提示海馬BDNF信號通路的改變與慢性應激致大鼠學習記憶的損害有關。而4周中等強度跑臺運動可以改善慢性應激導致的大鼠記憶損害，可能與規律運動激活海馬BDNF信號通路，增強海馬DG區BDNF的表達，增強海馬神經元的營養從而削弱慢性應激對大鼠的腦損害有關；因此，本研究從分子學角度證實跑臺運動在改善慢性應激導致的大鼠認知功能下降方面起重要的有益作用，具體機制需進一步研究。

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