電針刺激對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

張麗+彭頁(yè)

[摘要] 目的 研究腦缺血再灌注大鼠應(yīng)用電針刺激對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為臨床治療缺血性腦卒中提供依據(jù)。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SPF級(jí)雄性大鼠45只隨機(jī)分成三組（n = 15）：模型組、電針組、假手術(shù)組。模型組及電針組制作全腦缺血再灌注損傷模型，電針組進(jìn)行電針刺激，假手術(shù)組除術(shù)中不阻斷大腦中動(dòng)脈血流外，其余操作與模型組相同。采用Morris水迷宮對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)估，記錄其不同時(shí)間段逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)；Nissl染色計(jì)數(shù)殘存的CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目。 結(jié)果 模型組逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于假手術(shù)組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；電針組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)較模型組明顯減少，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)明顯減少（P < 0.05）；與模型組比較，電針組CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)明顯增多（P < 0.05）。 結(jié)論 電針刺激能夠顯著提高腦缺血再灌注動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力，推測(cè)其發(fā)生作用的機(jī)制應(yīng)與電針治療能夠保護(hù)腦缺血再灌注大鼠海馬的神經(jīng)作用關(guān)系密切。

[關(guān)鍵詞] 電針刺激；腦缺血再灌注；學(xué)習(xí)記憶能力

[中圖分類號(hào)] R254.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（a）-0070-04

[Abstract] Objective To study the influence of electroacupuncture stimulation on learning and memory ability in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury， and to provide evidence for the clinical treatment of ischemic stroke. Methods Forty-five SPF male rats were divided into 3 groups （n = 15）： model group， electroacupuncture group and sham operation group according to the random number table. The model group and electroacupuncture group were used to make the model of total cerebral ischemia-reperfusion injury. The electroacupuncture group was stimulated by electroacupunture， and the operation group did not block the blood flow in the middle of the cerebral artery， and the remaining operations were in the same with model group. The learning and memory ability of rats was assessed using Morris water maze， and the escape latency and the number of crossing the platform during different time periods were recorded； Nissl staining was used to count the number of neurons in CA1 and CA3. Results Compared with the sham operation group， the escape latency in the model group was prolonged significantly， and the frequency of crossing the platform was increased significantly （P < 0.05）. Compared with the model group， the escape latency in the electroacupuncture group was shortened， and the frequency of crossing the platform was decreased significantly （P < 0.05）. Compared with the sham operation group， the number of neurons for CA1 and CA3 in the model group was decreased （P < 0.05）. Compared with model group， the number of neurons in the electroacupuncture group was increased （P < 0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve learning and memory ability in cerebral ischemia rats， speculates that the mechanism may be related to its hippocampal nerve protective effect on cerebral ischemia reperfusion rats.

[Key words] Electric needle stimulation； Cerebral ischemia reperfusion； Learning and memory abilityendprint

學(xué)習(xí)記憶是大腦中最基本、最重要的高級(jí)神經(jīng)功能之一，大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示邊緣系統(tǒng)中的海馬與學(xué)習(xí)記憶有著密不可分的關(guān)系[1-2]。海馬中存在的許多和學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，如膽堿復(fù)合物、單胺類、肽類激酶等均參與學(xué)習(xí)記憶。大量的數(shù)據(jù)資料顯示，針刺對(duì)改善缺血性腦損傷有著較為顯著的治療效果，尤其對(duì)于超早期介入的缺血性腦損傷動(dòng)物[3]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，腦缺血再灌注可降低遲發(fā)性神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)記憶功能[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明電針?lè)ㄖ委熑毖阅X損傷效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)針灸治療法。但目前關(guān)于其機(jī)制的研究不多，尚缺乏統(tǒng)一的結(jié)論。本研究選取大鼠海馬區(qū)作為研究對(duì)象，探討電針對(duì)缺血性腦梗死大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響，分析其作用機(jī)制，為臨床治療卒中相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雄性大鼠45只，飲食自由，體重190～220 g，11～13周齡，使用許可證號(hào)：SCXK（陜）2016-0010，分籠飼養(yǎng)，溫度22℃左右，噪音<60 dB，換氣次數(shù)10～20次/h，環(huán)境亮度12 h亮/12 h暗交替。動(dòng)物均來(lái)源于寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在上述條件下飼養(yǎng)3 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成三組（n = 15）：模型組、電針組、假手術(shù)組。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 主要試劑和儀器

Nissl染色液：上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)173302；RhoA一抗（批號(hào)170109）、β-actin一抗（批號(hào)170309）、辣根過(guò)氧化物酶二抗（批號(hào)170111）均來(lái)源于Sigma公司。

日立全自動(dòng)生化分析儀7600（羅氏）；Morris水迷宮：上海欣軟信息科技有限公司；Image Lab3.0圖像分析系統(tǒng)：BIO-RAD公司。

1.3 各組處理及干預(yù)方法

大鼠全腦缺血再灌注損傷模型的建立：造模前所有大鼠均禁食不禁水12 h。模型建立采用血管阻斷法腹腔注射80 mg/kg異丙酚麻醉，于大鼠脊背頸中切口，充分暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處剪開(kāi)一0.1 cm小口，將栓線緩慢插入動(dòng)物的頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為20 mm左右。將事前放置好的頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾撤出，緩慢推動(dòng)栓線至大腦前動(dòng)脈。2 h后回抽栓線至頸總動(dòng)脈分叉處，造成大鼠缺血再灌注。造模后放置動(dòng)物于室溫環(huán)境下蘇醒，正常喂養(yǎng)。其中，依據(jù)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]評(píng)價(jià)造模成功與否：0分，大鼠無(wú)任何不對(duì)稱活動(dòng)；1分，拎尾巴時(shí)大鼠左前爪不能完全自由地伸展，左前肢活動(dòng)障礙明顯；2分，左前肢緊貼胸壁，左側(cè)轉(zhuǎn)彎明顯；3分，伴有明顯的左前爪后推，活動(dòng)僅能圍繞原點(diǎn)向左轉(zhuǎn)圈；4分，左側(cè)肢體完全不能支撐身體重量，僅能左側(cè)躺。評(píng)分在2～3分者定為造模成功。

各組干預(yù)方法：模型組制作腦缺血再灌注損傷模型；假手術(shù)組只分離動(dòng)脈，不結(jié)扎、插線，其余操作均同模型組；電針組在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行電針刺激干預(yù)，具體操作為：電針刺激前用腦立體定位儀器固定動(dòng)物。選取百會(huì)印堂腧穴，以30號(hào)針刺入0.1～0.2 cm后連接X(jué)S-998電針針灸儀的輸出電極上。選用頻率為30～50 Hz等波幅的交替疏密波。電針治療操作于術(shù)后第3天開(kāi)始，以后1次/d，每次半小時(shí)，共干預(yù)1周。

1.4 觀察及材料制備

采用Morris水迷宮檢驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力。將大鼠按順時(shí)針?lè)较驈牡谝?、二、三、四象限依次放入池壁，記? min內(nèi)逃避潛伏期，定位航行試驗(yàn)1次/d，總共7 d，前2 d為訓(xùn)練，不統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，逃避潛伏期從第3 天開(kāi)始進(jìn)行。第8 天進(jìn)行空間搜索試驗(yàn)，Morris水迷宮中央的平臺(tái)撤掉，然后選某一相同象限的同一入水點(diǎn)（本研究選擇第一象限）將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)放入迷宮，測(cè)定大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)。

記錄各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)。Morris水迷宮試驗(yàn)后，各組動(dòng)物麻醉后開(kāi)胸，生理鹽水200 mL經(jīng)左心室快速?zèng)_洗后將腦缺血區(qū)進(jìn)行定位，用4% pH=7.4的多聚甲醛400 mL灌流固定，4℃固定24～48 h。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯脫蠟石蠟包埋，冠狀切片（片厚5 μm），Nissl染色液染色，封片采用中性樹(shù)脂進(jìn)行。于高倍鏡視野下隨機(jī)選2個(gè)視野（400×），統(tǒng)計(jì)CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，最終值取2個(gè)視野的平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

45只大鼠在實(shí)驗(yàn)干預(yù)的過(guò)程中均無(wú)死亡。

2.1 三組大鼠不同時(shí)間段逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)比較

模型組逃避潛伏期較假手術(shù)組延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；電針組逃避潛伏期時(shí)間較模型組縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)比較

模型組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元較假手術(shù)組明顯減少，電針組較模型組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

缺血性腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)病。中醫(yī)辨證學(xué)認(rèn)為氣血是腦生長(zhǎng)發(fā)育、發(fā)揮多種功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，而氣血失常是導(dǎo)致腦病發(fā)生的主要病理病機(jī)[4-5]。針灸具有調(diào)補(bǔ)氣血的功效，同時(shí)其抗氧化應(yīng)激能力可減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)腦內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)循環(huán)灌流，從而減輕腦組織損傷，改善腦缺血再灌注損傷的不良癥狀[6-9]。針刺干預(yù)可激發(fā)動(dòng)物腦組織產(chǎn)生抗缺血缺氧的活性物質(zhì)，此類活性物質(zhì)可明顯提高組織器官尤其是腦組織的抗缺血缺氧能力，減輕腦缺血損傷后病理?yè)p傷程度，達(dá)到改善缺血缺氧損傷、治療疾病的目的[10-14]。endprint

中醫(yī)學(xué)辨證施治的理論認(rèn)為，百會(huì)屬督脈，是陽(yáng)脈之海，元神之府，行于脊柱而上行入腦。百會(huì)穴位于巔峰，為督脈之穴，可補(bǔ)氣益智，協(xié)調(diào)百脈，疏通腦絡(luò)，具有健腦寧神、安神定魄、增強(qiáng)記憶的功效是治療很多疾病的首選穴，醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值很高[15-19]。印堂具有活血化瘀、救逆止抽的功效。百會(huì)穴、印堂屬于經(jīng)外奇穴，具有寧心安神、明目通鼻的功效[20-25]。本研究結(jié)果顯示，模型組逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功，已達(dá)到腦缺血再灌注狀態(tài)；電針組逃避潛伏期較模型組縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，提示電針治療可以促進(jìn)腦梗死動(dòng)物的逃避潛伏期顯著縮短。本研究結(jié)果也顯示，模型組CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)較假手術(shù)組明顯減少，電針組神經(jīng)元數(shù)較模型組明顯增多，提示模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦缺血狀態(tài)已形成，電針干預(yù)能夠在某種程度上改善其學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上可知，電針刺激在一定程度上能夠提高腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其可能的機(jī)制與電針治療保護(hù)并激活腦缺血再灌注大鼠海馬的神經(jīng)作用關(guān)系密切，具體對(duì)海馬蛋白表達(dá)的影響將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深度研究。

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（收稿日期：2017-07-14 本文編輯：張瑜杰）endprint