短肢畸形胎兒FGFR3基因突變分析

蘇華+陳琛+張斌

[摘要] 目的 對超聲檢查疑為短肢畸形的胎兒進行致病基因成纖維細胞生長因子受體3（FGFR3）全外顯子突變分析產前基因診斷及遺傳咨詢。 方法 從UCSC Genome Bioinformatics數據庫中提取包括FGFR3基因全部17個外顯子的2個轉錄本的相關序列作為標準序列，設計合成FGFR3全基因外顯子擴增的共8對引物。收集2014年1月～2016年12月在河北北方學院附屬第一醫院就診的5例疑為短肢畸形的胎兒，對高危胎兒于B超引導下行羊水穿刺，富集細胞，對FGFR3基因外顯子組進行PCR擴增，應用Sanger基因測序技術進行FGFR3基因全外顯子測序，采用CodonCode Aligner軟件對測序結果進行錯義突變位點分析，判斷其是否存在致病突變。 結果 5例疑為短肢畸形的胎兒，其中1例胎兒FGFR3基因（轉錄本NM_000142.4）第7號外顯子（FGFR3-7-IS1）攜帶錯義突變C.1138G>A（P.Arg380Gly），其余4例未發現FGFR3基因突變。對明確了致病突變的5例孕早期胎兒家屬進行遺傳咨詢。 結論 對疑似短肢畸形胎兒應用基因測序技術進行產前FGFR3基因突變的檢測可以預防短肢畸形患兒的出生。

[關鍵詞] 短肢畸形；軟骨發育不全；成纖維細胞生長因子受體3；突變；產前診斷

[中圖分類號] R714.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（b）-0016-04

[Abstract] Objective To identify the fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR3） mutation of fetuses with short limbs deformity and carry out genetic counseling by fetuses found in ultrasound screening. Methods The genomic information of FGFR3 full 17 exon amplification from UCSC Genome Bioinformatics， including 2 genome transcripts were extracted as a standard sequence， 8 pairs of primers were designed. 5 fetuses suspected to be with short limb deformities in the First Affiliated Hospital of Hebei North University from January 2014 to December 2016 were selected and the amniotic fluid of the fetuses in high-risk was collected for detection of mutation of FGFR3 gene by polymerase chain reaction and Sanger gene sequencing. The mutation of the sequencing of FGFR3 gene was carried out by CodonCode Aligner software. Results Among the 5 fetuses with short limbs deformity， 1 case was carried mutations C.1138G> A （P.Arg380Gly） on the 7th （FGFR3-7-IS1， transcript NM_000142.4）. FGFR3 mutation were not found in the other 4 cases. Genetic counseling was conducted on 5 cases of fetal parents. Conclusion The detection of prenatal FGFR3 gene mutation in suspected patients using gene sequencing could effectively prevent the birth of short limb deformity patients.

[Key words] Short limb deformity； Achondroplasia； Fibroblast growth factor receptor-3； Mutation； Prenatal diagnosis

胎兒四肢骨骼發育異常是常見的出生缺陷之一，主要的臨床表現以四肢不同程度的肢端短小為主，多見于染色體的異常及各種綜合征。產前的超聲排畸檢查僅能給出提示而不能進行診斷，使遺傳咨詢的進一步處理困難重重，因此，對超聲排畸發現的短肢畸形胎兒盡可能的明確診斷，可為遺傳咨詢提供準確依據。成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor-3，FGFR3，OMIM 134934）基因被認為是與肢端發育異常相關的基因[1]，其突變所致的肢端發育異常疾病包括軟骨發育不全（achondroplasia，ACH）、致死性骨發育不良、成骨發育不全等。FGFR3基因突變發生位點的不同，可導致疾病發生的不同及程度的不同[2]。本研究對5例疑為短肢畸形的胎兒進行致病基因FGFR3全外顯子突變分析產前基因診斷及遺傳咨詢。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年12月在河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）就診的5例疑為短肢畸形的胎兒，獲得孕婦本人或家屬知情同意的情況下經B超引導行羊水穿刺，收集羊水細胞，進行FGFR3基因突變篩查。本研究經我院醫學倫理委員會通過并獲得家屬知情同意。endprint

1.2 一般情況

5例疑為短肢畸形的胎兒，其中4例為24～28周胎兒進行B型超聲排畸檢查，疑似短肢畸形的胎兒。1例孕母為臨床確診為ACH的患者，具有ACH典型的臨床表現[4]，身材矮小且不成比例，四肢短且粗，軀干細長，頭大、前額突出、塌鼻梁，肘關節不能伸直，雙腿呈“O”型，腰椎前突，手指短小具有典型的“三叉手”，臨床表現和放射學檢查符合ACH。對其胎兒行超聲排畸檢查發現胎兒具有ACH典型臨床特征：巨頭，與胎兒孕齡不符，枕骨大孔小，額部隆起，胎兒近端肢體進行性變短，四肢長骨短小，骨化差，骨后方聲影不明顯，胸腔狹小，肋骨細短，腹部或有膨隆并伴腹水，椎骨骨化差伴低回聲，孕婦可伴有全身水腫，羊水過多等，該孕婦于孕25周自愿進行FGFR3產前基因檢測。所有病例均經B超引導行羊水穿刺，收集羊水細胞，常規試劑盒提取DNA[血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP304）購自天根生化科技有限公司]，-20℃保存待檢。野生型對照標本取自我院體格正常的健康體檢者靜脈抗凝血。

1.3 FGFR3全外顯子基因檢測方法的建立

從UCSC Genome Bioinformatics數據庫（http：//www.genome.UCSC.edu）中提取FGFR3基因全部17個外顯子的核酸序列，包含全部2個轉錄本（FGFR3IS1：NM_000142.4；IS3：NM_001163213.1）的相關序列作為標準序列，設計并合成FGFR3基因PCR擴增引物共8對（見表1），應用Takara PT600梯度PCR儀對FGFR3基因外顯子組進行PCR擴增，反應總體系為25 μL，GC緩沖液Ⅱ 12.5 μL，1.25 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L引物各0.75 μL，LA Taq聚合酶（大連寶生物工程有限公司）1.25 U，基因組DNA模板0.5 μL（核酸濃度均在20～78 ng/μL，微量核酸濃度檢測儀側得吸光度A值為1.8～2.0）。PCR反應條件：95℃預變性4 min，93℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定產物片段大小是否與預期一致，并送公司測序（北京美吉生物技術有限公司）。

1.4 FGFR3突變篩查

對5例疑為短肢畸形的胎兒及其父母進行致病基因成纖維細胞生長因子受體3（FGFR3）全外顯子突變分析，測序結果用CodonCode Aligner軟件尋找突變位點，并通過HGMD數據庫及FGFR3基因數據庫對有意義的突變位點進行篩選。

1.5 遺傳咨詢

根據FGFR3基因檢測結果對5例受試胎兒家屬進行遺傳咨詢，告知胎兒父母胎兒患ACH可能性大小，指導胎兒父母進行是否繼續妊娠。

2 結果

2.1 FGFR3全外顯子基因檢測方法的建立

成功設計8對特異性引物，建立了FGFR3全外顯子基因檢測方法，對FGFR3基因兩個轉錄本的17個外顯子基因進行PCR擴增，片段長度符合預期，1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

2.2 FGFR3 基因突變檢測

對5例短肢畸形胎兒臍血和1例正常對照全血DNA進行FGFR3基因全外顯子組測序，發現1例孕母診斷為ACH患者的胎兒其FGFR3基因（轉錄本NM_000142.4）第7號外顯子（FGFR3-7-IS1）發生雜合突變c.1138G>A（p.Gly380Arg），結果見圖2A；野生型測序結果見圖2B。其余4例未檢出FGFR3基因突變。

2.3遺傳咨詢

得知FGFR3基因測序結果后，4例胎兒FGFR3基因無突變發生，未攜帶C.1138G>A（P.Arg380Gly）突變，將來為ACH患者的可能性小，經遺傳咨詢后其孕母及家屬選擇繼續妊娠。1例先天攜帶ACH致病突變C.1138G>A（P.Arg380Gly）胎兒，其孕母及家屬在得知產前診斷結果后，通過遺傳咨詢最終選擇終止妊娠。

3 討論

FGFR3基因是肢端發育異常最主要的致病基因，FGFR3基因定位于人類染色體4p16.3，包含17個外顯子，全長16.5 kb，編碼806個氨基酸的蛋白質分子，分子量為110 000～135 000 D[3]。FGFR3是酪氨酸激酶受體，是具有骨骼調節發育功能的跨膜蛋白，FGFR3受體蛋白包括3個部分：即胞外區、跨膜區和胞內區3部分組成，①胞外區為3個免疫球蛋白樣配體結構域組成（分別為IgⅠ、IgⅡ、IgⅢ），是糖基化的配體結合區，能與成纖維細胞生長因子發生作用，影響細胞的有絲分裂；②跨膜區是一個疏水區，跨膜1次，沒有可磷酸化的酪氨酸；③胞內區為近膜區和2酪氨酸激酶區（TK1和TK2）構成。FGFR3與其配體FGFs結合后，FGFR3發生二聚化，使酪氨酸激酶激活，胞內區下游含SH2結構域的信號分子和絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，進而激活細胞核內轉錄因子，進一步調節基因的轉錄和蛋白的表達[4-6]。

研究顯示，95%的ACH由FGFR3基因c.1138G>A（Gly380Arg）突變引起（其他罕見突變包括S84L、R200C、N262H、G268C、Y278C、V381E[7-9]），為常染色體顯性遺傳，該突變位于FGFR3蛋白跨膜區[10-11]。Zhou等[12]發現FGFR3蛋白跨膜區的G380R氨基酸發生突變使蛋白活化過程中形成二聚體更容易，可持續活化胞內區的酪氨酸激酶，從而激活胞內的信號傳導途徑，使軟骨細胞增殖和分化發生障礙，導致骨骼生長受限。Di Rocco等[13]通過小鼠動物模型Fgfr3（Y367C/+）觀察到，FGFR3基因突變導致FGFR3蛋白超活化，使受體過度降解，軟骨細胞增殖分化受到抑制，導致骨膜成熟障礙，是ACH發生的主要原因。有研究發現[14]，ACH的發生與父親年齡可能相關，隨著父親年齡的增長，精子生成時影響DNA復制、修補的因素可使精子細胞突變的機會增加。endprint

直接針對熱點突變的篩查可以排除95%的ACH，但少數罕見突變難以被發現，建議對肢端發育異常患者進行FGFR3全基因組突變篩查。Makrythanasis等[15]報道了1例嚴重的骨骼發育異常患者，臨床表型為脊柱歪斜，突出，“三叉戟”樣手，不能行走，該例患者首次發現了NM_000142.4：c.1637C>A：p.（Thr546Lys）突變，該突變位于FGFR3蛋白胞內激酶區，是季肋發育不全的突變熱點區域，因此FGFR3全基因外顯子突變的篩查對所有肢端發育異常患者的疾病診斷都是有重要意義的。

ACH是完全外顯的常染色體顯性遺傳，建議對B超診斷為肢端短小疑為ACH患者的胎兒已經不能僅僅停留在臨床監測的水平，還應進行FGFR3突變基因的產前基因診斷[16-17]。本文通過FGFR3全基因外顯子組測序的方法，實現高危胎兒產前基因診斷，結果顯示，5例短肢畸形胎兒，其中1例孕母診斷為ACH患者，其胎兒攜帶FGFR3基因c.1138G>A（p.Gly380Arg突變，父母通過遺傳咨詢選擇終止妊娠；其余4例父母均為野生型，胎兒未檢出FGFR3基因突變，經遺傳咨詢后將來為ACH患者的可能性小，選擇繼續妊娠。建議父母身材矮小的胎兒（侏儒癥的除外）應引起重視，適當選擇產前FGFR3突變熱點及全基因外顯子突變篩查[18-19]。產前突變篩查樣本包括胎兒羊水中提取DNA、絨毛膜絨毛細胞DNA、臍帶血淋巴及單核細胞DNA等[20]。方法除測序外也可采用PCR-高分辨率溶解測定法快速檢測熱點突變位點[21]。本研究強調FGFR3基因突變檢測在肢端發育異常胎兒產前診斷中的重要性，高危胎兒進行FGFR3產前基因突變篩查，可有效預防患兒的出生，實現優生優育。

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（收稿日期：2017-09-01 本文編輯：任 念）endprint