3種抗原修復(fù)方法對免疫組化染色效果的影響

鄭秋樺，李鈺湘，柯 野，張海明

（1.韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2.廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東廣州510663）

免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究.在免疫組織化學(xué)的試驗(yàn)過程中，常采用固定石蠟包埋組織，然而組織在使用甲醛固定過程中，形成的醛鍵會(huì)封閉抗原的決定簇，影響抗體和抗原的結(jié)合，從而影響染色觀察結(jié)果；因此，對抗原的修復(fù)在免疫組織化學(xué)中就尤為重要［1］.不同的抗原修復(fù)方法對免疫組化染色結(jié)果產(chǎn)生不同的影響［2-3］.如加熱抗原修復(fù)技術(shù)既能保留福爾馬林固定石蠟包埋技術(shù)良好的組織學(xué)形態(tài)，又明顯提高抗原的檢出率，提供良好的IHC染色結(jié)果［4-5］；影響加熱抗原修復(fù)的因素主要包括修復(fù)的溫度、加熱的時(shí)間、熱源、抗原修復(fù)液的pH值等方面［1］.

本文采用控制變量法，探究在改良Tris-EDTA(PH9.0)修復(fù)試劑中，采用水煮、微波和高壓3種不同的熱修復(fù)方法對P53、P63、Ki67、CK5/6、CK7這5個(gè)抗體的免疫組化染色效果的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)組織與試劑

1.1.1 試驗(yàn)組織

由廣州安必平（LBP）醫(yī)藥科技股份有限公司提供的陽性組織材料.

1.1.2 試驗(yàn)試劑

抗體試劑均由LBP公司提供的即用型產(chǎn)品（見表1）；環(huán)保透明脫蠟劑；無水乙醇；過氧化物酶封閉液（3%過氧化氫）；二抗試劑：LBP-VBrightI二抗HRP鼠兔通用型（一步法）；DAB顯色液（加強(qiáng)型）：1 mL DAB色原/20 mL DAB緩沖液；改良Tris-EDTA(PH9.0)濃縮液（50×）；Mayer’s蘇木素染液；PBS 緩沖粉：2 000 mL/包；Tween-20.

1.1.3 試劑的配制

DAB顯色液（加強(qiáng)型）：一滴DAB原液加入至1 mL DAB緩沖液中，該溶液易氧化，現(xiàn)配現(xiàn)用.

Tris-EDTA(pH9.0)修復(fù)液：改良Tris-EDTA(pH9.0)濃縮液（50×）40 mL加入1 960 mL的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?

表1 試驗(yàn)所用抗體信息

PBS緩沖液：一包PBS緩沖粉加入蒸餾水2 000 mL攪拌至粉末全部溶解加入4 mL Tween20繼續(xù)攪拌至完全融合即可.

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

Thermoscientific切片機(jī)、武漢俊杰電子有限公司生物組織攤烤片機(jī)、微波爐、Leica DM500顯微鏡、Leica ICC50 HD Camera、蘇泊爾YS20ED 20 cm高壓鍋.

1.3 方法

1.3.1 組織蠟塊的切片與前期處理

將五種組織蠟塊-20℃冷凍，2～3 min后取出，打開空氣加濕器減少靜電作用，在切片機(jī)上連續(xù)切片（2μm），放入20%的酒精中展片，再使用防脫載玻片進(jìn)行撈片，保證每張片撈的方向及位置一樣且盡可能在載玻片的中央處，以便閱片及效果對比.每個(gè)組織塊撈9片，在44℃熱水中進(jìn)行攤片使組織與載玻片平整粘附，無褶皺，60℃的烤片機(jī)上進(jìn)行烤片至組織與載玻片較牢固結(jié)合，不會(huì)由于重力作用而出現(xiàn)移位，將載玻片轉(zhuǎn)至耐高溫塑料切片架后，放入烘片機(jī)進(jìn)行55℃烘片2 h.

1.3.2 片子的脫蠟與水化

將已完成初步處理的片子放進(jìn)通風(fēng)櫥中的環(huán)保脫蠟劑（代替二甲苯）中進(jìn)行脫蠟處理3次，每次10 min，確保脫蠟干凈后進(jìn)行梯度水化，梯度水化為無水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每個(gè)梯度水化5 min.1.3.3抗原修復(fù)

1.3.3.1 水煮修復(fù)法

取2 000 mL修復(fù)液于不銹鋼鍋中，置于電磁爐上加熱至沸騰后，放入組織片進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)時(shí)間分別為10 min和20 min.

1.3.3.2 微波修復(fù)法

將組織切片放入2 000 mL修復(fù)液中置于微波爐中，微波爐高火（功率750 W）加熱至沸騰后，調(diào)至中火（功率375 W）開始修復(fù)，修復(fù)時(shí)間分別為10 min和20 min，修復(fù)后用自來水迅速降至室溫.

1.3.3.3 高壓修復(fù)法

將組織切片完全浸置于修復(fù)液中，放入高壓鍋內(nèi)0.1 MPa（121℃）分別進(jìn)行修復(fù)2 min、2.5 min、3 min和5 min，修復(fù)完后，迅速降壓降溫至常溫常壓后進(jìn)行清洗.

1.3.4 阻斷（內(nèi)源性過氧化物酶的滅活）

立即將修復(fù)完后的組織切片進(jìn)行多次水洗后，置于過氧化物酶封閉液中阻斷10min，再進(jìn)行水洗，然后置于PBS溶液中.

1.3.5 抗體孵育

從PBS溶液中取出組織切片，迅速甩干大量水珠，放于免疫組化濕盒中，快速滴加即用型一抗，23℃孵育30 min后，用PBS溶液沖洗后，置于PBS溶液清洗缸中取出組織切片去掉大部分水份滴加二抗，室溫孵育20 min，再用PBS沖洗后浸泡.

1.3.6 DAB顯色與蘇木素復(fù)染

從PBS溶液中取出組織切片，甩干大量水分后，迅速滴加DAB顯色液，顯色3 min后，吸干大部分顯色液后，置于DAB清洗液中多次水洗，然后用Mayer’s蘇木素溶液進(jìn)行復(fù)染30 s.

1.3.7 PBS返藍(lán)

將組織切片放進(jìn)PBS溶液中進(jìn)行返藍(lán)1 min，返藍(lán)后的蘇木素是標(biāo)記出細(xì)胞核的位置，方便觀察時(shí)做目標(biāo)區(qū)域的參照物，返藍(lán)后多次水洗.

1.3.8 脫水、透明、封片和鏡檢

將片子放進(jìn)95%乙醇脫水1min后，分別用無水乙醇脫水2次，每次1 min；將切片架放于環(huán)保透明脫蠟劑中脫蠟2次，每次3 min，用中性樹膠滴入封片后，標(biāo)記歸類；利用Leica ICC50 HD Camera進(jìn)行拍照保存，并對染色結(jié)果進(jìn)行評分.

1.4 評分標(biāo)準(zhǔn)

判斷評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行評分.評分方法1：在判斷中只考慮陽性細(xì)胞所占的百分比，按不同的百分比分級；將陽性細(xì)胞百分比分成5級，無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≦25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分.評分方法2：在判斷中只考慮陽性細(xì)胞的染色程度，按不同的染色強(qiáng)度分級；著色強(qiáng)度無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分［6］.試驗(yàn)中，Ki67 采用方法 1 的評分方法；CK5/6、CK7、P53和P63采用方法2的評分方法.

圖1 CK5/6的3種修復(fù)方法比較結(jié)果圖

圖2 CK7的3種修復(fù)方法比較結(jié)果圖

2 結(jié)果與分析

對5種抗體的3種修復(fù)方式，結(jié)果分別見圖1-5，評分結(jié)果見表2.由圖1-5和表2可知：5種抗體高壓修復(fù)的效果均為強(qiáng)表達(dá)；微波20 min修復(fù)P53和P63均為強(qiáng)表達(dá).CK5/6、CK7和ki67在高壓修復(fù)較其它兩種修復(fù)方式有更為理想的染色效果；從節(jié)省時(shí)間，降低掉片概率及出現(xiàn)背景概率等方面綜合考慮，故將Tris-EDTA(pH9.0)高壓修復(fù)2 min作為最佳修復(fù)方式.而P53及P63的微波修復(fù)20 min染色強(qiáng)度與高壓修復(fù)的結(jié)果一致，均為強(qiáng)陽性.5種抗體的水煮修復(fù)法的染色效果均不理想，主要由于修復(fù)液的大量蒸發(fā)不但浪費(fèi)試劑還有可能影響修復(fù)液濃度從而導(dǎo)致修復(fù)效果不穩(wěn)定，故不宜使用該方法.微波修復(fù)20 min對于部分組織的修復(fù)效果可以達(dá)到要求，但是微波修復(fù)也存在不足，如：長時(shí)間的浸泡和機(jī)械力容易導(dǎo)致掉片；修復(fù)液的大量蒸發(fā)浪費(fèi)試劑，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致干片，抗原失活.綜上所述，較佳的修復(fù)方式為高壓修復(fù)2 min.

圖3 ki67的3種修復(fù)方法比較結(jié)果圖

圖4 P53的3種修復(fù)方法比較結(jié)果圖

3 討論

免疫組織化學(xué)的染色質(zhì)量受整個(gè)試驗(yàn)過程多方面因素的影響，如溫度、抗原修復(fù)方法、抗體濃度、孵育時(shí)間及顯色時(shí)間等多種因素.抗原修復(fù)方法是關(guān)鍵的因素之一.由于采用不同的抗原修復(fù)方法，導(dǎo)致免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異極大甚至出現(xiàn)假陰性.因此尋找理想的抗原修復(fù)方式可提高抗原檢出率，提高免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性［7］.

圖5 P63的3種修復(fù)方法比較結(jié)果圖

表1 3種抗原修復(fù)法對免疫組化染色結(jié)果的比較

本研究僅對5種抗體采用了3種修復(fù)方式的研究，有待一步探究其它的修復(fù)方式，以期獲得更為直觀和方便可行的修復(fù)方法.

［1］姚梅宏,鄭智勇.免疫組化抗原修復(fù)技術(shù)新進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2013,29(5):544-547.

［2］陳余朋,張聲,王行富,等.不同的抗原修復(fù)方法在Ⅳ型膠原免疫組化染色中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(1):98-100.

［3］宿穎,劉曼,張辛燕.不同抗原修復(fù)方法對KLF4在小鼠舌黏膜上皮中表達(dá)的比較[J].北京口腔醫(yī)學(xué)，2014,14(6):344-346.

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［5］Shi S R,Taylor C R.Extended application of antigen retrieval technique in immunohistochemistry and in situ hybridization[A].Shi S R，Taylor C R，eds.Antigen retrieval immunohistochemistry based research and diagnostics[C].Hoboken:John Wiley,2010:25-45．

［6］許良中，楊文淘.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國癌癥雜志,1996,6(4):229-231.

［7］何新明,顧霞,郭文婷,等.免疫組織化學(xué)染色存在的問題及解決方案[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2017,24(8):871-872.