貴陽地區2015年手足口病柯薩奇病毒A6、A10型的檢測分析*

楊興林,洪章萍，王 藝，李 麗，梁躍東△,黃 海

(1.貴州省貴陽市公共衛生救治中心 550004；2.貴州醫科大學檢驗學院，貴陽 550004)

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒(EV)引起的出疹發熱急性傳染病，引起HFMD的病毒屬于小RNA病毒科EV屬，引發HFMD 的病毒有20多個血清型，包括柯薩奇病毒A組(coxsackie virus A,CVA)的2、4、5、7、9、10、16型等，B組(coxsackie virus B,CVB)的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)，?？刹《?echovirus,ECHO)等。其中以EV71及CVA16型較為常見。目前有研究報道，發現其他型EV也能導致HFMD。近年來在歐洲及我國周邊部分國家爆發的HFMD疫情中，CVA6、CVA10型等已經替代EV71和CVA16被作為主要致病病原體。2008年在新加坡HFMD的流行,病毒血清型以CVA6、CVA10型為主[1]，同年芬蘭爆發了CVA6、CVA10型為主的HFMD[2]，2010年法國HFMD病原調查中，CVA10和CVA6型是主要型別[3]。近幾年在我國廣東、福建等地也相繼有CVA6型和A10型引起HFMD的報道[4-6]。

2013年4-6月本課題組前期開展了1 410份HFMD臨床標本病原研究報道[7]，對100份其他血清型EV抽取標本進行PCR產物測序分析，結果CVA6為46例、CVA10為30例、CVA5為10例、CVA2為6例、CVA3和CVA4各2例、CVAB2和ECHO 16各2例。CVA6和CVA10型為本地區HFMD的優勢EV型別。為進一步了解貴陽地區引起HFMD的CVA6和CVA10型EV的病原構成，擬通過建立一種熒光定量RT- PCR方法，快速篩查HFMD 病原提供實驗依據，為臨床EV的診斷提供一種有效、快速的檢測手段。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月20日至6月19日，在貴陽市公共衛生救治中心感染科門診的HFMD患兒607例，年齡1個月至11歲，男359例，女248例。診斷標準參照均符合《HFMD診療指南》(2010年版)及《諸福棠實用兒科學》HFMD診斷標準。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑 病毒檢測用RNA提取試劑盒購自北京天根公司，一步法實時熒光反轉錄PCR擴增體系(Uotaq Probe 1-Step RT-qPCR System)購自美國PROMEGA公司， 羅氏Cobas z 480熒光定量PCR儀，臺式高速離心機德國Eppendorf公司生產，探針、引物的合成由上海生工生物技術有限公司合成。EV71、CVA16熒光PCR試劑和EV通用型熒光PCR試劑采用上海之江生物科技有限公司。

1.2.2標本采集 病毒采樣管使用北京友康基業生物科技有限公司提供，在患兒就診當天由經培訓護士用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后，迅速將棉簽放入病毒采樣管中，采樣管外表貼上患者條碼號碼。2 h內送實驗室，-20 ℃低溫保存，2 d內用熒光PCR法檢測EV通用型、EV71、CVA16核酸，對EV通用型陽性、EV71核酸陰性、CVA16核酸陰性的標本于-80 ℃低溫保存。

1.2.3引物探針的設計與合成 從GenBank上下載不同年份和地區的CVA6、CVA10基因序列，用生物學軟件進行同源性比較，在保守區polyprotein gene設計特異性引物和TaqMan探針。引物和探針由上海生工公司合成，探針5′端標記的熒光報告基團是FAM,3′端標記的熒光淬滅基團是BHQ，見表1。

1.2.4CVA6與CVA10熒光定量RT-PCR反應體系 總反應體系為50 μL，包括dNTPs(20 mmol/L) 1.3 μL上下游引物各0.20 μL探針0.20 μL，Mg2+(1 mmol/L) 0.18 μL，PCR核苷酸混合物10 μL，反轉錄聚合酶(200 U/μL) 0.3 μL，熱啟動Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL，酶稀釋液0.7 μL，模板RNA 5 μL，最后補充焦碳酸二乙酯處理水(DEPC)至50 μL。反應條件：50 ℃ 15 min，95 ℃預變性 15 min，95 ℃變性5 s，退火/延伸:60 ℃ 45 s；40個循環。在每個循環退火延伸結束時檢測熒光信號，熒光模式設為FAM/BHQ雙標記模式。

1.2.5熒光定量結果判讀 在羅氏Cobas z 480熒光定量PCR儀上進行檢測。熒光通道檢測選擇：選用FAM通道。結果判斷：檢測Ct值，≤38為陽性，>38～40時重復檢測一次，若依舊在此范圍則為陰性。

表1 CVA6、CVA10熒光定量PCR引物和探針序列

F:正向引物；R:反向引物；P：熒光基因

1.2.6基因測序 隨機選取各5份熒光定量RT-PCR檢測病毒的陽性標本，方法按照本課題組以前的方法進行[7]，委托上海生工生物工程有限公司進行基因測序，進一步驗證所建方法的準確性。

2 結 果

2.1HFMD年齡性別分布情況 2015年共收集607份臨床診斷為HFMD的標本，患兒發病年齡1月至10歲，平均(2.7±1.2)歲，0～3歲組病例最多，占56.84%。男359例，女248例，男女比例1.45∶1，其各型EV在男女間差異均無統計學意義(χ2=5.939,P=0.676)，見表2。

表2 607例PCR熒光檢測EV在性別分布情況(n)

表3 607例標本PCR熒光檢測EV結果

2.2臨床EV熒光定量PCR檢測情況 在607份臨床標本中，EV通用型的陽性為361例，檢出率為59.47%；其中EV71 44例(7.25%)；CVA16陽性69例(11.37%)；EV71與CVA16同時陽性1例(0.16%)，CVA6陽性11例(1.81%)，CVA10陽性71例(11.70%)，其他血清型EV 164例(27.02%)。在陽性構成比中以CVA10 、CVA16、EV71為主，還有45.43%未明確的其他型EV，見表3。

2.3不同年齡的病原學檢測結果 貴陽地區2015年HFMD 不同年齡組EV陽性檢出率差異無統計學意義(χ2=4.566，P=0.603)；不同年齡組之間病原體型別構成比差異無統計學意義(χ2=37.018，P=0.189)。 CVA6、CVA10以1～2 歲年齡組為主，分別占各病原體型別總數的54.55%(6/11) 和30.99%(22/71)，同時發現EV71+CVA16及CVA6+CV10的混合感染各1例，見表4。

表4 不同年齡的病原學檢測結果(n)

2.4測序驗證 為確認CVA6和CVA10檢測結果，從上面陽性的樣本隨機抽取5例，使用自行設計的CVA6和CVA10特異性引物對標本進行驗證，證實RT-PCR的測序結果與特異性引物檢測結果一致。

3 討 論

除了EV71和CVA16之外，非EV71非CVA16的EV不斷引起HFMD的暴發流行逐漸引起人們關注，近年來CVA10、CVA6和CVA3等多種也逐漸演變成為HFMD的常見病原體[1-10]。我國在HFMD監測中發現HFMD的病原體主要是EV71和CVA16，因此目前市場提供的HFMD病原檢測商品試劑盒主要是針對EV71和CVA16鑒定，在常規的病原學核酸檢測除用EV通用引物進行檢測外，只進行EV71和CVA16的分型檢測。用實時熒光定量PCR檢測方法，具有更高的靈敏度和特異度，操作簡便快捷，是一種快速可靠又經濟有效的核酸擴增分子檢測方法，易推廣。

本研究運用實時熒光PCR技術，采用CVA6、CVA10高度特異的引物和熒光標記探針建立檢測CVA6、CVA10的方法，同時用測序的方法對其陽性的樣本進行驗證結果相符，采用獲得國家注冊批準的商品試劑盒檢測EV71、CVA16。對貴陽地區2015年5-6月607例臨床HFMD病例進行核酸檢測，發現病原體為其他EV為主的檢出率為59.47%，其次CVA10占11.70%，CVA16占11.37%；EV71占7.25%，CVA6占1.81%，同時檢出EV71+CVA16及CVA6+CVA10各1例。其檢測數據與貴陽地區2010年報道[11]、2011年報道[12]及2013年報道[7]相比變化不大。本次檢測中以CVA10為主，可能與每年的交叉流行有關。通過近年來對本地區EV病原監測，說明本地區的HFMD病原體主要是非EV71、非CVA16型的其他型EV感染，對這些未分型EV進一步分型鑒定，將有助于全面了解本地區HFMD的病原譜，同時有助于分析是否存在非EV71、非CVA16的其他優勢病毒型別，為HFMD防控工作提供明確的病原學依據。

在本研究中CVA6與CVA10在男女性別構成分布上差異無統計學意義(P>0.05)，在年齡構成主要分布上CVA10在3歲以下而CVA6更集中在2歲以下，有報道表明，CVA6型病毒感染多見于1～2歲患兒，相比EV71和CVA16感染患兒平均年齡要小，這意味著該病毒的感染可能會引起更多的并發癥[13]，提示在日常監測工作中應重視CVA6 病毒引起的HFMD。本研究及以往研究均提示貴陽地區HFMD中存在EV71、CVA16共感染及CVA6、CVA10型EV共感染現象[14]，有報道顯示EV71和CVA16混合感染更易導致中樞神經系統并發癥，加重危害[15]，因此應加強共感染在HFMD流行中作用的監測研究。

CVA6和CVA10是單股正鏈RNA病毒屬于人類腸道病毒(HEV)，HEV按血清型分為脊髓灰質類病毒(poliovirus,PV1～3型)、CVA型(CVA1～22和24型)、CVB型(CVB1～6型)、?？刹《?ECHO1～7、9、11～27、29～33型)及新型EV。在HEV-A所引起的疾病中，以HFMD最為常見。近年來國內外報道CVA6、CVA10及其他EV流行的文獻不斷增多，CVA6引起的HFMD約有56%的病例會形成大于1 cm的大皰疹、有硬痂，導致脫甲癥的發生，進而發生重癥HFMD。

臨床醫生對CVA16、EV71引起的輕癥及重癥HFMD了解較多，能夠及時、準確診斷，但對于CVA6、CVA10等引起的HFMD臨床表現認識不足，所以應加強HFMD病原學監測，及時掌握流行型別，并對醫務人員及家長進行宣傳培訓。

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