亞抑菌濃度哌拉西林/他唑巴坦對大腸埃希菌生物膜形成能力的影響

宋 潔，洪 海，馮 偉，熊 瑋

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院老年科，重慶 400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院預(yù)防保健科，重慶 400038；3.北京總后勤部鄭常莊干休所衛(wèi)生所，北京 100141；4.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶 400038)

抗菌藥物是臨床抗感染治療的常用藥物。在治療過程中，抗菌藥物血藥濃度會有部分時間低于最低抑菌濃度而處于亞抑菌濃度(sub-minimal inhibitory concentration，亞-MIC)狀態(tài)，這是抗菌藥物治療過程中不可避免的情況。研究表明亞-MIC抗菌藥物能夠影響細(xì)菌的毒力、生物膜和運動性[1-3]。哌拉西林屬于半合成的廣譜青霉素類抗生素，可治療敏感細(xì)菌引起的感染。哌拉西林與他唑巴坦聯(lián)合可用于治療對哌拉西林耐藥而對哌拉西林/他唑巴坦敏感的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌引起的中、重度感染。有研究報道亞-MIC哌拉西林可以導(dǎo)致大腸埃希菌形態(tài)改變而產(chǎn)生絲狀體[4]，然而關(guān)于亞-MIC哌拉西林/他唑巴坦對大腸埃希菌生物膜形成能力的影響尚未見報道。因此，本研究以大腸埃希菌臨床菌株為研究對象，觀察亞-MIC哌拉西林/他唑巴坦對大腸埃希菌生物膜形成、黏附性和運動性的影響，為臨床抗感染治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 大腸埃希菌臨床株(E156-E160)及藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922保存于第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科。

1.1.2試劑和儀器 哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，PTZ)、結(jié)晶紫購自美國Sigma公司；MH培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；血瓊脂平板購自重慶龐通公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司；氯化鈉購自升博生物制品公司；冰醋酸購自重慶川東化工有限公司。Multiskan型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法

1.2.1大腸埃希菌最低抑菌濃度(MIC)的檢測 大腸埃希菌MIC檢測采用微量肉湯稀釋法。大腸埃希菌劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃孵育18 h。挑取細(xì)菌少許單菌落于4 mL無菌生理鹽水稀釋校正至0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝?1.5×108CFU/mL)，然后再用水解酪蛋白(MH)肉湯稀釋100倍。PTZ用MH肉湯倍比稀釋至11個濃度梯度(0.25～256.00 μg/mL)。然后在96孔板中每孔加入100 μL稀釋菌液和100 μL系列濃度PTZ。96孔板放入37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h。細(xì)菌MIC值為能夠抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI，2014)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.2.2亞-MIC PTZ對大腸埃希菌生物膜形成能力的影響 生物膜形成能力的檢測采用96孔板結(jié)晶紫染色法[5]。大腸埃希菌劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑取單菌落于10 mL LB肉湯，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。過夜培養(yǎng)物用LB肉湯稀釋1 000倍。PTZ組每孔加入100 μL菌液和100 μL PTZ，使藥物終濃度為1/4 MIC；空白對照組每孔加入100 μL菌液和100 μL LB肉湯。每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。輕輕吸出孔中的浮游菌，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，通風(fēng)陰涼處倒置晾干。然后在每孔中加入200 μL 1 %結(jié)晶紫溶液，染色10 min，自來水沖洗3次，通風(fēng)陰涼處再次倒置自然晾干。最后每孔加入100 μL 30 %冰醋酸溶液，使用酶標(biāo)儀在590 nm處測定吸光度值。

1.2.3亞-MIC PTZ對大腸埃希菌黏附性的影響 黏附能力檢測采用菌落平板計數(shù)法[6]。將大腸埃希菌過夜培養(yǎng)物用LB肉湯稀釋1 000倍。實驗分為空白對照組和PTZ處理組。PTZ處理組在激光共聚焦顯微鏡專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1 mL菌液和1 mL PTZ，使其藥物終濃度為1/4 MIC。空白對照組加入1 mL菌液和1 mL LB培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)4 h后，用無菌的PBS緩沖液輕輕沖洗2次以去除浮游菌。然后在培養(yǎng)皿中加入適量的PBS緩沖液超聲10 min，使黏附細(xì)胞脫落下來。最后將細(xì)胞懸浮液用無菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，取100 μL稀釋菌液加在LB固體培養(yǎng)基上并涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h后計算細(xì)菌數(shù)量。每個標(biāo)本設(shè)置3個平行組，實驗重復(fù)3次。

1.2.4亞-MIC PTZ對大腸埃希菌運動性的影響 通過泳動運動檢測亞-MIC PTZ對大腸埃希菌運動性的影響[7]。將大腸埃希菌過夜培養(yǎng)物稀釋校正至3個麥?zhǔn)媳葷釂挝?9×108CFU/mL)，取5 μL稀釋菌液加在不含和含有1/4 MIC PTZ的半固體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%氯化鈉，0.3%瓊脂，pH 7.1～7.3)表面。37 ℃培養(yǎng)6 h后觀察細(xì)菌菌落直徑大小。每個標(biāo)本設(shè)置3個平行組，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1PTZ對大腸埃希菌的MIC結(jié)果 PTZ對大腸埃希菌E156-E160的MIC結(jié)果分別為4、16、128、32、1 μg/mL。由于1/2 MIC抗菌藥物對細(xì)菌生長有影響，因此，后續(xù)研究均采用1/4 MIC PTZ進(jìn)行實驗。

2.2亞-MIC PTZ對大腸埃希菌生物膜形成能力的影響 與空白對照組相比，PTZ能顯著降低大腸埃希菌E156-E160生物膜的形成能力，其P值分別為0.003、0.022、0.022、0.006和0.025，見圖1。

a：P<0.01；b：P<0.05

圖1亞-MIC PTZ對大腸埃希菌生物膜形成能力的影響

2.3亞-MIC PTZ對大腸埃希菌黏附性的影響 與空白對照組相比，亞-MIC PTZ對5株大腸埃希菌E156-E160的黏附性均有顯著抑制作用，其P值分別為0.002、0.016、0.004、0.003和0.003。PTZ處理組大腸埃希菌黏附細(xì)胞數(shù)減低比例為28.1%～43.0%，見圖2。

a:P<0.01；bP<0.05

圖2亞-MIC PTZ對大腸埃希菌黏附性的影響

2.4亞-MIC PTZ對大腸埃希菌運動性的影響 與空白對照組相比，PTZ處理組細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基上的菌落直徑明顯變小，其P值分別為0.025、0.005、0.001、0.042和0.017，提示PTZ能顯著降低細(xì)菌的運動性，見圖3。

a：P<0.01；b：P<0.05

圖3亞-MIC PTZ對大腸埃希菌運動性的影響

3 討 論

大腸埃希菌是臨床常見致病菌，容易在感染過程中形成生物膜，而生物膜形成是多重耐藥大腸埃希菌耐藥性獲得和傳播的重要機制。由于亞-MIC在臨床抗感染過程中是不可避免的，因此研究亞-MIC抗菌藥物對細(xì)菌生物膜形成能力的調(diào)控具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示亞-MIC PTZ對大腸埃希菌生物膜形成具有顯著的抑制作用。有研究表明亞-MIC PTZ對銅綠假單胞菌和具核梭桿菌生物膜形成均有抑制作用[8-9]，這與本研究結(jié)果相類似。大腸埃希菌生物膜形成的過程包括初始黏附和生物膜的形成，黏附能力是生物膜形成的重要影響因素[10-11]。結(jié)果顯示亞-MIC PTZ在抑制生物膜形成的同時可以抑制大腸埃希菌的黏附性，提示PTZ可通過抑制大腸埃希菌的黏附性而抑制其生物膜的形成。

鞭毛是大腸埃希菌的運動器官，其所介導(dǎo)的運動性在細(xì)菌最初的表面黏附和后期生物膜的形成中都具有重要的作用[12-13]。有研究表明鞭毛和運動缺陷的銅綠假單胞菌突變株其生物膜形成能力降低[14]。WOOD等[15]研究報道運動性強的大腸埃希菌生物膜形成能力顯著高于運動性弱的細(xì)菌。HORII等[16]報道亞-MIC頭孢他啶通過運動性影響銅綠假單胞菌及奇異變形桿菌黏附及生物膜形成。本研究顯示亞-MIC PTZ能夠顯著抑制大腸埃希菌的泳動運動，與其他研究報道一致[17]，結(jié)果提示亞-MIC PTZ可能通過抑制細(xì)菌運動性來抑制細(xì)菌生物膜的形成。本研究表明亞-MIC PTZ可能通過抑制大腸埃希菌的黏附性和運動性從而抑制其生物膜的形成，但是其具體機制有待于進(jìn)一步研究。

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