培哚普利改善心室重構作用與Gal-3的相關性

張躍華，李樹仁，鄧文浩，楊玲玲，郝 瀟，李 沙

(河北醫(yī)科大學研究生學院/河北省人民醫(yī)院心內一科，石家莊 050051)

心力衰竭是一種復雜的臨床征候群，是各種心血管疾病的嚴重階段，而心室重構被認為是心力衰竭發(fā)展的基礎[1]。已有眾多基礎和臨床研究表明，心室重構在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用[2-4]。近年來，減慢或延緩心室重構的進展成為治療心力衰竭的主要方向。目前半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)與心力衰竭和心室重構的關系備受關注。近期研究表明Gal-3促進心肌纖維化、參與心肌炎性改變和心室重塑等過程[5]。所以Gal-3有可能作為一種新型的心力衰竭指標，運用在心力衰竭的診斷和預后方面，而抑制Gal-3的表達和作用也將成為治療心力衰竭的一個新方向。然而血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)作為心力衰竭的治療的基石，可以改善心室重構，但其機制還不完全清楚，ACEI改善缺血性心力衰竭家兔心室重構作用是否與Gal-3的表達相關尚不明確。本研究通過應用培哚普利治療心肌梗死后心功能障礙家兔，檢測家兔心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的 mRNA 和蛋白的表達、血清Gal-3水平和心功能的變化，觀察應用培哚普利治療和未應用培哚普利治療對Gal-3的水平、心功能的影響，探討可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 本實驗選用健康 3 月齡新西蘭雄性家兔(合格證號：1606173)30只，每只體質量約2.5 kg，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2試驗與儀器 培哚普利片(雅施達制藥有限公司，中國)；注射用青霉素鈉 (華北制藥，中國)；兔血清Galectin-3 ELISA試劑盒(上海藍基科技公司，中國)；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，中國)、UltraSYBR Mixture(CWbio.Co.Ltd，中國)、5 RNA上樣緩沖(CWbio.Co.Ltd，中國)。心臟超聲儀(TOSHIBA，日本)；低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，中國)；渦旋振蕩儀QL-902(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)；分光光度計NANODROP 2000(Thermo scientific，美國)；熒光定量PCR儀Line Gene 9600 Plus(Bioer Technology，中國)；雙垂直電泳槽(CAVOY MP-8001，中國)；轉移槽(CAVOY MP-3030，中國)；溫控搖床(其林貝爾TS-2000A，中國)；電泳儀(CAVOY PP-1150，中國)。

1.2方法

1.2.1分組及處理 30只家兔分為假手術組、心力衰竭組和培哚普利組，每組10只，分別檢測術后2周左室射血分數(shù)(LVEF)，LVEF<50%為模型制作成功。模型制作成功后假手術組和心力衰竭組均以2 mL·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃4 周，培哚普利組以2 mL·kg-1·d-1的培哚普利(藥物的濃度為0.33 mg/mL) 灌胃4 周。

1.2.2動物模型制備 采用結扎前降支的方法制作心功能障礙模型。記錄術前心電圖后開胸結扎冠狀動脈前降支，模型制備成功標準為心尖部及左室前壁由紅色變?yōu)榘底仙植啃募∵\動異常，心電圖示胸前導聯(lián) ST 段持續(xù)弓背向上抬高[6]。假手術組只開胸不結扎冠狀動脈前降支，模型制備后心尖部及左室前壁無顏色變化，心肌運動無異常，心電圖示胸前導聯(lián) ST 段未抬高。兩組術后 3 d每天青霉素 80 萬單位肌內注射。

1.2.3心功能檢測 術前、術后2周及4周由同一人行超聲心動圖檢查，測量兩組LVEF、左室舒張末期內徑(end diastolic diameter，EDD)。所有測量值均取3 次測量的平均值。

1.2.4梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的mRNA的表達的檢測 給藥4 周后，取心肌梗死區(qū)域心肌組織進行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測其完整性;按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件為:42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。Actin 上游引物5′-AGA TCG TGC GGG ACA TCA AG-3′,下游引物5′-CAG GAA GGA GGG CTG GAA GA-3′，擴增產(chǎn)物為182 bp；Ⅰ型膠原的上游引物為5′-TGA GCC AGC AGA TTG AGA ACA T-3′，下游引物為5′-TGT CGC AGA AGA CCT TGA TGG-3′，擴增產(chǎn)物為165 bp;Ⅲ型膠原 的上游引物5′-GTA CAA CTA GCA TTC CTC CGA CTG-3′，下游引物為5′-TTA GAG CAG CCA TCC TCC AGA AC-3′，擴增產(chǎn)物為203 bp;Gal-3的上游引物為5′-CTG TGC CTT ATG ACC TGC CTC T-3′，下游引物為5′-TCA TTG ACC GCA ACC TTG AAG TG-3′，擴增產(chǎn)物為301 bp。將獲得的cDNA 按照實時熒光定量PCR 試劑盒操作說明書方法擴增目的基因，PCR 熱循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 4 min，然后3 步反應:95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45個循環(huán)。以Actin為內參照，將目的基因表達的相對定量值用于統(tǒng)計學分析。PCR采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-Actin Ct值，ΔΔCt = 目的基因ΔCt 值- 內參照基因ΔCt 值) 法計算結果[7]。將所得的Gal-3 mRNA表達量與LVEF 進行相關性分析。

1.2.5梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的檢測 將梗死區(qū)的心肌組織稱重后研磨提取組織中的蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分離膠，5%濃縮膠，進行丙烯酰胺凝膠電泳，然后濕轉膜，最后用Western blot 試劑盒顯色、ECL發(fā)光反應檢測并分析目的蛋白。將所得的Gal-3蛋白水平與LVEF 進行相關性分析。

1.2.6血清中Gal-3的檢測 分別在術前、術后2、4周，經(jīng)家兔耳中動脈取血，離心15 min 后取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作;依據(jù)標準品濃度及其A值計算相應公式;依據(jù)公式和樣品A值計算標本Gal-3的濃度，然后將所得的血清Gal-3 的濃度與LVEF 進行相關性分析。

2 結 果

2.1造模結果 30只新西蘭雄性家兔在造模術后共有24 只存活。假手術組存活8只，死亡2只，其中1只于手術過程中大出血死亡，另1只開胸過程中發(fā)生氣胸而死亡。心力衰竭組存活 8只，死亡2只,2只于結扎前降支的過程中誘發(fā)室顫而死亡。培哚普利組存活8只，死亡2只，1只于開胸過程中發(fā)生氣胸而死亡，另1只于結扎前降支的過程中誘發(fā)室顫而死亡。

2.2心功能檢查結果 對術前3組的超聲結果行單因素方差分析，結果顯示LVEF差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，術后2周心力衰竭組和培哚普利組的LVEF明顯減小(P<0.05),術后4周培哚普利組較心力衰竭組的LVEF上升(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 各組術后4周的超聲心動圖

2.3梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達 與假手術組相比，心力衰竭組與培哚普利組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，培哚普利組較心力衰竭組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達減少(P<0.05)。相關性分析顯示Gal-3與LVEF呈負相關(r=-0.912，P<0.05)，見表2。

表1 各組間術前、術后2、4周后LVEF的比較

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

表2 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達的比較

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

2.4梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的蛋白水平 Western blot的檢測結果表明,與假手術組相比，心力衰竭組和培哚普利組梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白水平增加(P<0.05)，培哚普利組較心力衰竭組Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白水平減少(P<0.05)。相關性分析顯示Gal-3與LVEF呈負相關(r=-0.809，P<0.05)，見表3，圖3。

表3 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白水平比較

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

圖3 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原Western-blob的檢測結果

2.5血清Gal-3水平 3組術前血清中Gal-3的水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后4周培哚普利組血清Gal-3水平較心力衰竭組下降(P<0.05)，與假手術組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相關性分析顯示，Gal-3與LVEF呈負相關(r=-0.925，P<0.05)，見表4。

表4 各組間術前、術后2、4周Gal-3的濃度比較

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

3 討 論

1989年BAUMBACH等[8]提出心室重構這個概念。心室重構被認為是心力衰竭發(fā)展的基礎，是心力衰竭患者發(fā)病率和死亡率的決定因素，所以減慢或延緩心室重構的進展成為治療心力衰竭的主要方向。然而ACEI作為心力衰竭的治療基石，其在逆轉心室重構和心肌纖維化的作用越來越受關注。近幾年的研究表明ACEI逆轉心室重構的作用機制除了抑制血管緊張素Ⅱ生成外，還可增加前列腺素的合成、抑制緩激肽的降解等，但其抑制心肌纖維化的研究尚少，機制不完全明確。近期已有研究表明，Gal-3在眾多心血管疾病中也起著重要作用[9-12]，其參與心肌纖維化，促進了心室重構和心力衰竭的發(fā)展。同時期也有研究表明Gal-3可能是抗心室重構治療的一個靶點[13-15]。

縱觀國內外研究發(fā)現(xiàn)，RASS系統(tǒng)與Gal-3之間關系研究較為少見。本研究檢測結果進行分析發(fā)現(xiàn)，培哚普利組與心力衰竭組比較，心肌組織中的纖維蛋白明顯減少，與此同時Gal-3的表達也明顯減少。由此可見培哚普利改善心肌纖維化很可能與Gal-3的表達減少有關。Gal-3 mRNA表達水平、Gal-3蛋白水平都與LVEF存在負相關，這就表明隨著Gal-3水平的下降心功能在逐漸升高。這也反映培哚普利改善心功能很有可能與Gal-3水平降低有關。由此可見培哚普利在抑制心肌纖維化、減緩心室重構過程中與Gal-3的表達存在很大相關性。

本研究通過應用培哚普利治療心肌梗死后心功能障礙家兔，改善缺血性心力衰竭家兔的心功能，驗證了培哚普利減少Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達，抑制心肌纖維化，減緩心室重構過程與Gal-3的表達存在很大相關性。Gal-3很可能是培哚普利改善心室重構作用的一個新的治療靶點，值得進一步研究。

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