阿托伐他汀對K562細胞的抗增殖作用及凋亡作用的研究

孔春芳，周江龍，丁偉榮，丁江華，陳國安，程洪波，金成豪

(1.江西省人民醫院，南昌 330006；2.江西省南昌市第三醫院 330006；3.南昌大學第一附屬醫院 330006)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種發生在多能造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病，目前，CML急變患者治療效果仍較差，探索對CML急變期有效的新型藥物很有必要。他汀類藥物是一類3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，主要用于預防和治療心腦血管疾病。近期研究證實：他汀類藥物對多種實體腫瘤具有抗癌作用[1]。作為第三代他汀類代表，阿托伐他汀臨床應用非常廣泛。有研究發現，阿托伐他汀等可影響K562細胞的增殖，但具體機制尚不清楚[2]。因此，本研究以K562細胞系為實驗對象，探討阿托伐他汀對其的作用及機制，旨在為阿托伐他汀臨床治療CML急變提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 人CML急變期細胞系K562細胞由南昌大學第一附屬醫院血液科實驗室提供。主要實驗試劑包括：阿托伐他汀、RNA酶(RNAase)、碘化丙啶(PI)均購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)，AnnexinV-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)，半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、-8、-9活性測定試劑盒(碧云天公司)，RNA提取試劑盒(Qiagen 公司)，Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒(Tiangen公司)，RealMasterMix(SYBR Green，Tiangen公司)。實驗主要儀器為BD FACS流式細胞儀與Mx3000P熒光定量PCR儀。

1.2方法

1.2.1細胞培養 K562細胞培養于10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組 分為不同濃度阿托伐他汀組(12.5、25.0和50.0 μmol/L)與陰性對照組(阿托伐他汀0 μmol/L)。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖抑制 收集對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL。接種細胞(1×104個/孔)于96孔板，按上述實驗分組加入不同濃度阿托伐他汀，同時設立空白對照組(無細胞懸液，不加阿托伐他汀)，每組設3個重復孔。置培養箱內分別孵育24、48及72 h，每孔加入CCK-8試劑20 μL，繼續培養1 h，酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，實驗重復3次。細胞增殖抑制率=100%-[(A給藥組-A空白孔) /(A陰性對照組-A空白孔)]×100%。

1.2.4AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 分不同濃度阿托伐他汀組(即12.5、25.0和50.0 μmol/L)與陰性對照組(阿托伐他汀0 μmol/L)后置培養箱內孵育72 h，收集各組細胞，4 ℃預冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞2次，調整細胞濃度為1×106個/mL。加入500 μL結合緩沖液，離心棄上清，再加入100 μL結合緩沖液混勻后，分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻；室溫避光反應15 min。最后加入結合緩沖液400 μL，1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 分不同濃度阿托伐他汀組(即12.5、25.0和50.0 μmol/L)與陰性對照組(阿托伐他汀0 μmol/L)置培養箱內孵育72 h，收集各組細胞，4 ℃預冷PBS洗滌細胞2次，調整細胞濃度為1×106個/mL，重懸于0.5 mL PBS，加入2～3 mL 70%預冷乙醇中混勻，4 ℃保存過夜。次日離心棄乙醇，再用PBS緩沖液洗滌2次，加入PI/RNase，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀測定細胞周期。

1.2.6比色法檢測細胞caspase-3、-8、-9活性 分不同濃度阿托伐他汀組(即12.5、25.0和50.0 μmol/L)與陰性對照組(阿托伐他汀0 μmol/L)后置培養箱內孵育72 h，收集各組細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，提取蛋白后按Bradford法檢測蛋白水平，調整蛋白水平在1～3 mg/mL范圍。最后根據 caspase-3、-8、-9活性測定試劑盒說明書，分別檢測caspase-3、-8、-9活性。

1.2.7qRT-PCR檢測Bcl-2及程序性死亡因子(PDCD5)基因表達 分不同濃度阿托伐他汀組(即25.0、50.0 μmol/L)與陰性對照組(阿托伐他汀0 μmol/L)后置培養箱內孵育72 h，收集各組細胞，調整細胞濃度為1×107個/mL。用Qiagen試劑盒提取總RNA，紫外分光光度法檢測RNA含量，A260/A280在1.8～2.0之間說明RNA純度較好，用于反轉錄。根據試劑盒說明配制反轉錄反應體系，37 ℃反應60 min。最后按SYBRGreen說明書進行熒光定量PCR擴增。引物設計：從文獻中檢索所需要的Bcl-2、PDCD5、β-actin基因引物，后進行驗證，通過軟件進行評價并選取最優引物，送至上海生物工程公司合成，見表1。

表1 PCR引物序列和產物長度

1.2.8瓊脂糖電泳檢測擴增產物 分別取Bcl-2、PDCD5、β-actin擴增產物及DNA梯狀標志，將上樣緩沖液和待測DNA樣品混勻，依次加至加樣孔中，電泳結束后觀察結果并拍照。

2 結 果

2.1阿托伐他汀對K562細胞增殖的影響 12.5、25.0與50.0 μmol/L濃度阿托伐他汀處理K562細胞24 h后細胞增殖抑制率分別為(6.11±0.74)、(12.50±1.24)、(27.46±1.43)%；48 h后分別為(13.74±1.33)、(26.01±0.62)、(39.33±1.90)%；72 h后分別為(25.29±1.08)、(37.68±1.04)、(59.24±0.81)%，均高于同時間段陰性對照組(P<0.05)。隨作用時間延長，阿托伐他汀對 K562 細胞增殖抑制率亦相應增強(P<0.05)。提示阿托伐他汀對K562 細胞增殖抑制作用呈濃度與時間依賴性，見圖1。

圖1 不同濃度阿托伐他汀作用 K562細胞24、48、72 h細胞增殖抑制率

2.2阿托伐他汀對K562細胞凋亡的影響 12.5、25.0與50.0 μmol/L阿托伐他汀處理K562細胞72 h，細胞凋亡率分別為(14.11±1.12)、(22.89±0.87)、(47.35±1.41)%，顯著高于陰性對照組(4.85±0.91)%(P<0.01)，且3組濃度阿托伐他汀的細胞凋亡率組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3阿托伐他汀對K562細胞周期變化的情況 12.5、25.0與50.0 μmol/L阿托伐他汀作用K562 細胞72 h后，G0/G1期細胞百分比分別為(20.93±1.35)、(40.18±1.07)、(53.29±1.09)%，顯著高于陰性對照組(16.35±0.75)%(P<0.01)；同樣，3組S期細胞百分比分別為 (68.29±0.66)、(49.98±1.14)、(39.09±0.87)%，顯著高于陰性對照組 (71.17±1.25)% (P<0.01)，表明阿托伐他汀呈濃度依賴性誘導K562細胞阻滯于G1/S期，見圖3。

2.4阿托伐他汀作用K562細胞caspase-3、-8、-9活性的變化 12.5、25.0與50.0 μmol/L阿托伐他汀作用 K562 細胞 72 h，與陰性對照組相比較，caspase-3、-8、-9活性明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。表明阿托伐他汀可能通過活化caspase-3、-8、-9誘導K562細胞凋亡，見圖4。

圖2 不同濃度阿托伐他汀作用K562細胞72 h的細胞凋亡率

圖3 不同濃度阿托伐他汀作用K562細胞72 h的細胞周期變化

2.5阿托伐他汀作用K562細胞Bcl-2及PDCD5基因表達變化 與陰性對照組比較，25.0、50.0 μmol/L阿托伐他汀處理K562細胞72 h， Bcl-2 mRNA分別下降了25.7%和53.6%(P<0.01)；而PDCD5 mRNA表達分別上升至5.627倍和17.815倍(P<0.01)，見圖5。

圖4 不同濃度阿托伐他汀作用 K562 細胞72 h后caspase-3、-8、-9相對活性

圖5 不同濃度阿托伐他汀作用K562細胞Bcl-2、PDCD5 mRNA表達變化

3 討 論

近年來，CML的治療從傳統的化療藥物到造血干細胞移植再到酪氨酸激酶抑制劑的應用，其臨床療效得到顯著的提高；然而，CML急變期的患者仍對該類藥物存在原發或繼發耐藥[3]。因此探索CML急變期新的高效低毒的化療藥物仍非常有必要。研究發現，他汀類藥物可抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡或分化，影響細胞周期及信號傳導等作用，而對正常細胞毒副作用不明顯[4]。阿托伐他汀作為第三代他汀類的代表藥物，不良反應小，其抗腫瘤作用也逐漸成為研究熱點。在本實驗中，阿托伐他汀呈濃度和時間依賴性抑制K562細胞增殖，與BESSLER等[2]研究結果相似，提示阿托伐他汀在K562細胞中具有抗白血病作用。

抗腫瘤藥物在影響腫瘤細胞增殖的同時還可誘導細胞凋亡、導致細胞周期變化。BURANRAT等[5]發現阿托伐他汀可誘導人膽管癌細胞株的凋亡，同時能提升caspase-3及p21的水平。AJITH等[6]發現阿托伐他汀通過誘導淋巴瘤細胞凋亡，發揮抗淋巴瘤的效應。WOLFE等[7]發現辛伐他汀可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖和遷移并誘導細胞阻滯于G1/S期。本實驗證實：阿托伐他汀呈濃度依賴性的誘導細胞凋亡并阻滯K562細胞周期于G1/S。caspase家族在細胞凋亡中起關鍵作用。KANUGULA等[8]發現氟伐他汀通過提高caspase-3、-8活性，誘導乳腺癌細胞凋亡。在本實驗中，阿托伐他汀可激活caspase-3、-8、-9的活性，誘導K562細胞凋亡。Bcl-2家族在細胞凋亡中起至關重要作用，其異常表達與CML細胞的惡性增殖與存活密切相關[9]。SCHOINTUCH等[10]發現辛伐他汀明顯上調caspase-3表達，而下調Bcl-2，誘導子宮內膜癌細胞凋亡。WOOD等[11]發現，高濃度的辛伐他汀可能通過抑制Bcl-2的表達誘導腫瘤細胞凋亡。PDCD5是一種新的促凋亡基因。本實驗結果發現阿托伐他汀明顯下調Bcl-2，上調PDCD5表達。

綜上所述，阿托伐他汀可作為一種潛在的抗白血病藥物。由于本研究屬于體外實驗，有必要進一步探討其在體內的抗白血病效應及與化療藥物的協同作用，這將有望為CML急變期的患者設計一些靶向新療法以提高患者生存質量。

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