γ-H2AX的表達(dá)對(duì)初診多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后影響*

曹 春，徐 莉，馮 娟，唐海龍，董紅娟，顧宏濤，舒汨汨，白慶咸， 梁 蓉，張 濤，楊 嵐，董寶俠，陳協(xié)群，高廣勛

(第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科/中國(guó)人民解放軍血液病專病中心，西安 710032)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是血液系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤，病理特點(diǎn)為骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆并分泌大量免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，造成靶器官損害并引發(fā)相關(guān)臨床表現(xiàn)。在新藥時(shí)期，靶向治療明顯改善了患者的臨床預(yù)后，但并不能完全治愈MM，大多數(shù)患者最終仍死于疾病的進(jìn)展和復(fù)發(fā)[1]。雖然Durie-Salmon、國(guó)際分期體系(ISS)、R-ISS、mSmart等預(yù)后分期體系及危險(xiǎn)分層體系目前已在臨床用于患者的預(yù)后評(píng)估[2]，但仍不能完全有效地評(píng)估患者預(yù)后。此外，隨著對(duì)MM發(fā)病的分子生物學(xué)的研究不斷深入，其他潛在預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志也越來越受到關(guān)注。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂(DSB)的早期標(biāo)志物，γ-H2AX灶是細(xì)胞老化和腫瘤發(fā)生的標(biāo)志，由γ-H2AX蛋白在DSB位點(diǎn)上大量聚集而成[3]。有研究表明，在腫瘤增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中，γ-H2AX均扮演了相當(dāng)重要的角色。更有研究發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX表達(dá)增高與腫瘤患者的不良預(yù)后關(guān)系密切。因此本研究擬探究MM患者骨髓中γ-H2AX的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月1日至2016年12月31日本院確診的初診MM患者為病例組，MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)是中國(guó)MM工作組于2015年制定的《中國(guó)MM診治指南》，在此之前的患者均依據(jù)2015年的指南來重新評(píng)估其病歷及診斷，符合者納入研究，并排除不符合者，疾病分期采用 2005年ISS系統(tǒng)。對(duì)照組則選擇本院非造血系統(tǒng)腫瘤者經(jīng)骨髓細(xì)胞涂片和活檢均顯示其造血系統(tǒng)無明顯異常者。所有MM患者及對(duì)照者均在取骨髓活檢組織前均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床和病理資料的收集 (1)一般人口學(xué)資料：性別，年齡，聯(lián)系方式等；臨床檢查資料：血常規(guī)、血生化、免疫球蛋白系列、免疫固定電泳、乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、血清游離輕鏈、X射線、磁共振(MRI)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET-CT)等；細(xì)胞、分子遺傳學(xué)資料：流式細(xì)胞學(xué)和FISH結(jié)果；治療：治療方案和療效評(píng)估。(2)病理資料：收集病例組MM患者和對(duì)照者的骨髓活檢標(biāo)本。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)γ-H2AX在骨髓中的表達(dá) (1)石蠟包埋組織切片，烤片2 h；(2)二甲苯梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水；(3)檸檬酸鈉100 ℃水浴修復(fù)抗原20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5 min×3次；(4)3%的過氧化氫阻斷30 min，PBS沖洗5 min×3次，山羊血清封閉2 h；(5)兔抗人γ-H2AX多克隆抗體(Abcam，ab2893，1∶1 000)4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，SP-9001兔SP試劑盒(北京中杉金橋)中生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次；(6)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(北京中杉金橋)，蘇木素復(fù)染，0.5%鹽酸乙醇分化；(7)梯度乙醇脫水，二甲苯透明；(8)樹膠封片。

1.2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀 每張切片隨機(jī)取5個(gè)盡可能避開骨髓間質(zhì)部分的視野(×400)，采用顯微成像系統(tǒng)(Olympus bx50)拍攝照片，然后利用 Image-ProPlus6.0(IPP)圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析，測(cè)量每張照片的累積光密度值(integral optical density，IOD)，并計(jì)算其平均光密度(mean density，MD)值，MD=IOD/區(qū)域面積×5，表示每個(gè)測(cè)試者骨髓組織中γ-H2AX的相對(duì)表達(dá)量。再分別計(jì)算病例組和對(duì)照組所有入組患者M(jìn)D的均值，分別用MD1和MD2表示，比較其γ-H2AX表達(dá)的差異性。對(duì)于病例組患者，根據(jù)MD1值將其分為兩組，一組為γ-H2AX相對(duì)表達(dá)量大于或等于MD1所代表的患者，定義為γ-H2AX強(qiáng)表達(dá)組；另一組為γ-H2AX表達(dá)量小于MD1者，定義為γ-H2AX弱表達(dá)組。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料的統(tǒng)計(jì) 病例組共入組102例初診MM患者，其中男61例，女41例，中位發(fā)病年齡為56.5(32～77)歲；對(duì)照組32例，其中男15例，女17例，中位年齡35.5(23～65)歲。病例組患者ISS分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期34例，Ⅲ期50例；M蛋白分型：IgG型42例，IgA型26例，IgD1例，IgM1例，λ輕鏈型24例，κ輕鏈型8例；LDH均值為(178.6±79.6)μmol/L。FISH結(jié)果采用2015年國(guó)際MM工作組(IMWG)分類標(biāo)準(zhǔn)，將FISH-MM系列陰性視為正常組，48例；探針檢測(cè)到del(17p)，t(4；14)(p16；q32)或t(14；16)(q32；q23)易位中任何一項(xiàng)視為高危組，10例；介于兩者之間為標(biāo)危組，44例。入組患者治療方案及治療效果見表1，連續(xù)4個(gè)療程治療結(jié)束后根據(jù) IMWG 療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效反應(yīng)將部分緩解(PR)及其以上的治療效果視為治療有效，其余記為療效欠佳，治療的總體有效率為61.8%。對(duì)入組患者電話隨訪至2016年12月31日，75人存活，27人死亡，中位生存時(shí)間為23(6～51)個(gè)月。

2.2γ-H2AX在病例及對(duì)照組間的表達(dá) 病例組及對(duì)照組骨髓中均可見γ-H2AX的表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)定位在細(xì)胞核內(nèi)，表現(xiàn)為棕色、棕黃色或黃色的顆粒物質(zhì)。病例組γ-H2AX表達(dá)的MD值為(6.78±3.47)，對(duì)照組為(1.10±0.83)，病例組MM患者的γ-H2AX表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

表1 各誘導(dǎo)方案的治療效果

A：對(duì)照組γ-H2AX的IHC染色；B、C、D：病例組患者γ-H2AX的IHC染色；B：γ-H2AX弱表達(dá)組；C、D：γ-H2AX強(qiáng)表達(dá)組

圖1 γ-H2AX在不同骨髓組織中的表達(dá)情況(×400)

A：γ-H2AX染色結(jié)果；B：FISH結(jié)果；C：LDH水平；D：治療效果對(duì)患者生存時(shí)間的影響

圖2患者生存曲線與各影響因素的關(guān)系

2.3γ-H2AX的表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系 γ-H2AX蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、疾病類型、疾病分期及FISH結(jié)果等均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 γ-H2AX的表達(dá)與MM患者不同臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 γ-H2AX的表達(dá)與MM患者不同臨床病理特征的關(guān)系

2.4γ-H2AX的表達(dá)與MM患者預(yù)后的關(guān)系 由Kaplan-Meier生存曲線圖和Log-rank檢驗(yàn)的單因素分析可知患者的LDH水平、FISH結(jié)果、治療效果和γ-H2AX染色結(jié)果都是影響患者平均存活時(shí)間的因素(P<0.05)；而年齡、性別和ISS分期則與其平均存活時(shí)間無明顯相關(guān)(P>0.05)，見表3、圖2。

表3 MM患者生存的Log-rank單因素分析

續(xù)表3 MM患者生存的Log-rank單因素分析

2.5影響患者生存的多因素分析 為進(jìn)一步探討上述各因素是否為患者的獨(dú)立預(yù)后因素，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的多因素分析顯示，F(xiàn)ISH結(jié)果和LDH水平不作為患者的預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05)，而γ-H2AX染色結(jié)果和治療效果均與患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。即γ-H2AX的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)，可作為患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素，見表4。

表4 影響患者生存的多因素分析

a：所有FISH結(jié)果對(duì)患者的生存影響分析；b：正常組FISH結(jié)果作為參照；c：標(biāo)危組和正常組FISH結(jié)果比較后對(duì)患者的生存影響分析；d：高危組和正常組FISH結(jié)果比較后對(duì)患者的生存影響分析

3 討 論

MM患者的臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后差異也較大。從發(fā)病到病程演變，MM細(xì)胞不斷接受來自骨髓微環(huán)境中各種因子的刺激，相互作用下可調(diào)整MM細(xì)胞的功能狀態(tài)并介導(dǎo)促腫瘤生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素6(IL-6)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)等，因此針對(duì)MM細(xì)胞及其所處環(huán)境的一些生物因子的變化研究，更能解釋疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[4-5]。

γ-H2AX是細(xì)胞發(fā)生DSB后，H2AX組蛋白上的第139位的絲氨酸發(fā)生磷酸化而形成的，因此是DSB的早期標(biāo)志物。外源性或內(nèi)源性損傷造成DSB后，γ-H2AX的修復(fù)作用重大，它可阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)DNA修復(fù)，保持基因的穩(wěn)定性。而未被修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)的細(xì)胞則可能會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡、突變或轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。未完全修復(fù)的細(xì)胞，其γ-H2AX灶將進(jìn)一步擴(kuò)大。一般內(nèi)源性γ-H2AX灶在正常人原代細(xì)胞和組織中很少表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞和癌前病變中，即使無外源性DSB，也可檢測(cè)到高水平的γ-H2AX[6-7]。有研究者發(fā)現(xiàn)黑色素瘤、結(jié)腸癌、骨肉瘤、纖維肉瘤和宮頸癌等癌組織中γ-H2AX表達(dá)增高，這預(yù)示著γ-H2AX與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8]。MATSUDA等[9]研究發(fā)現(xiàn)肝癌的癌前病變組織內(nèi)γ-H2AX表達(dá)增加，是預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生的重要生物學(xué)事件；另有研究發(fā)現(xiàn)BRCA1/ BRCA2突變的輸卵管上皮細(xì)胞(此類細(xì)胞高風(fēng)險(xiǎn)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變)中γ-H2AX異常高表達(dá)[10]。以上均提示DNA損傷反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生中扮演重要角色。本研究中γ-H2AX的半定量工作由IPP軟件完成，因γ-H2AX表達(dá)于細(xì)胞核，所以IPP識(shí)別圖中所有細(xì)胞核部位的著色，但未區(qū)分MM細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞，因此γ-H2AX的表達(dá)量是指患者發(fā)生MM后骨髓中γ-H2AX表達(dá)的整體情況。結(jié)果顯示病例組和對(duì)照組的骨髓組織中均有γ-H2AX的表達(dá)，但γ-H2AX在MM患者骨髓中的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，這一結(jié)果與上述基礎(chǔ)結(jié)論相符，說明γ-H2AX的高表達(dá)是隨MM發(fā)生而出現(xiàn)的。單克隆免疫球蛋白疾病(MGUS)可向MM高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是MM的癌前病變，γ-H2AX在其骨髓中是否同樣高表達(dá)，尚未可知。

此外，γ-H2AX與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后也關(guān)系密切。THANAN等[11]研究發(fā)現(xiàn)部分CD133和Oct3/4陽性的膽管癌患者，γ-H2AX大量表達(dá)，從而造成細(xì)胞基因組失穩(wěn)定，使腫瘤的侵襲性增強(qiáng)。OKA等[12]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌進(jìn)展的過程中，由氧化、復(fù)制和機(jī)械應(yīng)力引起的DNA損傷反應(yīng)(DDR)始終處于激活狀態(tài)，但由DDR引發(fā)的腫瘤細(xì)胞凋亡卻極少，相反，γ-H2AX的表達(dá)卻持續(xù)維持在較高水平，提示γ-H2AX的高表達(dá)與結(jié)腸癌的不良預(yù)后有關(guān)。在部分臨床預(yù)后較差的三陰性乳腺癌患者的病理組織中也可檢測(cè)到大量表達(dá)的γ-H2AX[13]。另有研究證明γ-H2AX是非小細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，γ-H2AX高表達(dá)患者的生存時(shí)間相對(duì)較短；對(duì)術(shù)后喉部鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后研究也得出了同樣的結(jié)論[8,14-15]。

以上研究說明γ-H2AX的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究已經(jīng)明確MM患者的γ-H2AX表達(dá)高于對(duì)照者，為進(jìn)一步探討γ-H2AX與MM患者預(yù)后的關(guān)系，分析了γ-H2AX的表達(dá)與患者的臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示γ-H2AX在不同年齡和不同性別的患者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在不同疾病類型、分期及不同遺傳學(xué)分層的患者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單因素分析顯示γ-H2AX高表達(dá)與MM患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；多因素分析進(jìn)一步提示γ-H2AX的高表達(dá)是MM患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，γ-H2AX在MM患者的骨髓組織中的表達(dá)水平增高，且γ-H2AX的強(qiáng)表達(dá)與MM患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，預(yù)示患者較差的臨床結(jié)局，因此γ-H2AX的表達(dá)升高可能是影響MM患者生存的不良預(yù)后因素。

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