江西古桑樹桑葉中活性成分含量的測定

黃金枝 俞燕芳 杜賢明 鄧真華

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

我國自古就有栽桑養蠶的傳統，全國各地遺留下來的古桑樹是我國栽桑養蠶的活化石。由于自然和人為原因，這些古桑樹的生存現狀不容樂觀，目前幸存的千年古桑樹已為數不多。這些經歷千年風霜的古桑樹，不僅彰顯了我國是栽桑養蠶的發源地，且給世人留下了觀賞古桑樹風貌的機遇，同時這些上千年、數百年的古桑樹也給我們留下了很多動人的傳說[1]。近年來江西省蠶桑茶葉研究所經多方咨詢考察，發現江西省古桑樹資源分布較多地方為吉安地區。

桑葉的主要成分除水分以外，還含有豐富的蛋白質、碳水化合物、 無機鹽、維生素以及人體所需的多種微量元素，具有降血壓、降血脂、抗衰老、增加耐力、降低膽固醇、抑制腸內有害細菌繁殖和過氧化物產生等獨特的功效，對人體有良好的保健作用[2]。桑葉中含有黃酮及其苷、生物堿、多糖、揮發油、各種氨基酸、微量元素等[3]，成分比較復雜，黃酮類成分是主要有效成分之一[4]。桑葉黃酮具有抗衰老作用[5]和抑菌活性[6]，生物堿類中主要的功效成分1-脫氧野尻霉素是α-葡萄糖甘酶抑制劑，具有降血糖、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤轉移等多種生物活性。本文以吉安地區生長的古桑樹桑葉為試驗材料，分析測定其桑葉中的總酚、總黃酮、DNJ和多酚單體的含量，以期為功能性成分桑品種的選育和品種評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的基本情況

根據北京古樹名木評價標準(DB11/T478-2007)，胸徑≥100，分級級別為一級，胸徑≥50cm，分級級別為二級。

供試桑品種均采自于江西省吉安地區，其性狀見表1。由表1可知，試驗桑樹的樣品均為古桑樹，其中葉1號樹為一級，其它為二級。

表1 吉安地區古桑基本性狀調查表

1.2 試驗方法與設備

新鮮桑葉于60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，備用。測定時準確稱取一定重量，重復取3次，用于桑葉活性成分含量測定。

設備：Agilent 1260高效液相色譜(美國安捷倫科技公司)、722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 總酚含量測定

稱取不同古桑桑葉樣品，置50mL離心管中，加80%乙醇30mL，超聲提取3次，每次30min。10 000rpm離心5min，合并提取液，過濾并轉入100mL容量瓶中，以80%乙醇定容，即得待測桑葉總酚的供試品。測定方法采用福林-肖卡法[7～8]，以沒食子酸標準品作標準曲線計算總酚類物質的含量。

1.3.2 總黃酮含量測定

提取方法同1.3.1。測定方法采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁為標準曲線計算總黃酮含量[2]。

1.3.3 DNJ含量測定

稱取0.1g干燥至恒重的桑葉粉末，精密稱定，于10mL的離心管中，加0.05mol/L的鹽酸溶液10mL，渦旋提取3min，離心15min(轉速12 000r/min)，取上清液，殘渣加0.05mol/L的鹽酸溶液10mL,同法重復提取一次，離心，合并2次提取液并轉移至50mL容量瓶，蒸餾水定容即得待測的供試品。

準確稱取20mgDNJ標準品于25mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，即得0.8g/L的DNJ標準溶液，稀釋至質量濃度為60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL備用。以DNJ的質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，得DNJ的標準曲線線性回歸方程。

取DNJ提取液(或DNJ標準液)100μL，再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL，混勻后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應，加入1%醋酸100μL及超純水400μL，以0.45μm微孔濾膜過濾器過濾，收集濾液備測。空白對照以蒸餾水代替DNJ提取液進行衍生化反應。

色譜條件：色譜柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm)；熒光檢測器激發波長254nm，發射波長322nm；流動相為乙腈-0.1%醋酸(體積比50:50)；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量10μL。

1.3.4 多酚單體含量測定

提取方法同1.3.1。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相A-乙腈、B-0.4%冰醋酸，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長280nm。梯度洗脫程序：B泵在0～40min時，95%降至75%；在40～45min時，由75%降至65%；在45～50min時，由65%降至50%[9]。

標準曲線制備：準確稱取綠原酸、蘆丁、槲皮素和龍膽酸標樣各0.0100g，用純甲醇定容至10mL，4℃保存備測。

2 結果與分析

2.1 不同古桑樹桑葉中總酚含量的變化

根據實驗方法制作標準曲線，回歸方程式 y =3.7434x+0.0525，R2=0.9973，表明沒食子酸質量濃度為0.02～0.2mg/mL范圍內與其吸光值呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉總酚的定量測定。不同桑葉總酚含量的測定結果見圖1，由圖1可知不同桑葉總酚含量存在差異，葉2和葉3差異不顯著(p>0.05)，葉1、葉4、葉5和葉6差異極顯著(p<0.01)，其中葉6中總酚含量最高，均值高達18.31mg/g，葉4次之，均值為17.39mg/g，葉2含量最低，均值為13.16mg/g。

圖1 不同古桑樹桑葉中總酚含量的變化

2.2 不同古桑樹桑葉中總黃酮含量的變化

根據實驗方法制作標準曲線，回歸方程式 y =1.4586x-0.0167，R2=0.999，表明蘆丁質量濃度為0.1 ～0.6mg/mL范圍內與其吸光值呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉總黃酮的定量測定。不同桑葉總黃酮含量的測定結果見

圖2，由圖2可知不同桑葉總黃酮含量存在差異，葉1、葉2和葉5差異不顯著(p>0.05)，葉3、葉4和葉6差異極顯著(p<0.01)，其中葉4中總黃酮含量最高，均值高達35.24mg/g，葉6次之，均值為31.68mg/g，葉3含量最低，均值為25.59mg/g。

圖2 不同古桑樹桑葉中總黃酮含量的變化

2.3 不同古桑樹桑葉中DNJ含量的變化

根據實驗方法制作標準曲線，回歸方程式 y =0.1557x+1.8258，R2=0.9952，x軸代表峰面積，y軸代表濃度，表明DNJ質量濃度為11.2 ～56μg/mL范圍內與其峰面積呈現良好的線性關系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于桑葉DNJ的定量測定。不同古桑樹桑葉DNJ含量的測定結果見圖3，由圖3可知，品種不同DNJ含量存在很大的差異。葉1樣的DNJ含量最高，高達8.63mg/g，是葉5樣的10倍。從DNJ含量角度考慮，可以把葉1樣株作為特殊種質資源加以保存。

圖3 不同古桑樹桑葉中DNJ含量的變化

2.4 不同古桑樹桑葉中多酚單體含量的變化

2.4.1液相色譜標準曲線的制備

在確定的色譜條件下測定不同質量濃度的標準品混合液，以各梯度質量濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，得到各類多酚單體的回歸方程(表1)。各標樣質量濃度與峰面積的相關性良好，相關系數(R2)在0.9994以上。

2.4.2 不同古桑樹桑葉中多酚單體物質色譜圖

不同古桑樹桑葉中多酚單體色譜圖見圖4。由圖4可以看出，不同古桑樹桑葉中多酚單體物質得到了較好的分離，且圖譜相似，共有峰較多。

2.4.3 不同古桑樹桑葉中多酚單體物質含量變化

不同古桑樹桑葉多酚單體含量的變化見表2。由表2可知，葉6中綠原酸含量最高，為11.47mg/g，不同古桑樹桑葉之間綠原酸含量大小關系：葉6>葉4>葉5>葉1>葉2>葉3；葉5中蘆丁含量最高，為1.99mg/g，不同古桑樹桑葉之間蘆丁含量的高低關系：葉5>葉6>葉4>葉1>葉3>葉2；葉6中槲皮素含量最高，為0.60mg/g，不同古桑樹桑葉之間槲皮素含量高低關系：葉6>葉4>葉5>葉1>葉2>葉3；葉6中龍膽酸含量最高，為2.12mg/g，不同古桑樹桑葉之間龍膽酸含量順序：葉6>葉4>葉5>葉1>葉3>葉2。綜合來看葉6中多酚單體含量相對較高。

表1 4種多酚單體物質的標準曲線

表2 不同古桑樹桑葉中多酚單體物質含量變化

圖4 不同古桑樹桑葉中多酚單體液相色譜圖

3 小結與討論

通過對6株古桑樹桑葉總黃酮含量進行測定，發現不同株的古桑樹桑葉總黃酮含量差異顯著。不同地方、不同樹齡的古桑樹，其桑葉多酚含量存在差異，有的還達到極顯著水平。不同株的古桑樹桑葉DNJ含量也存在很大的差異，葉1樣的DNJ含量最高，高達8.63mg/g，是葉5樣的10倍。從DNJ含量角度考慮，可以把葉1號樣株作為特殊種質資源加以保存。

不同桑葉營養成分含量上的差異除了受本身遺傳和生理特性影響外，還受栽培地區氣候、土壤和栽培條件的影響，桑葉作為一種藥食兩用的植物，評價其營養品質好壞的指標有很多，包括蛋白、脂肪、多糖、總酸、纖維、多酚、黃酮等，但根據其用途的不同，營養評價指標也有所不同。因而在營養評價上要有選擇性，做到有的放矢，物盡其用[10]。

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