乳制品中膠原蛋白檢測方法的研究

李春梅，侯典朋，王丹，任璐瑤，沈思宇

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院,哈爾濱 150028；2.黑龍江東方學院食品工程，哈爾濱 150066；3.吉林大學食品加工與安全，長春 130012）

0 引 言

近些年來，隨著膠原蛋白提取技術的發展，膠原蛋白越來越受到普通大眾的關注。作為生物體內含量最多的一種蛋白質，可以應用到乳及乳制品、保健品、化妝品、醫學等領域，應用范圍多樣化導致其有很好的發展前景。膠原蛋白是一種不透明、白色、無支鏈的纖維蛋白質，分布在動物全身各個組織器官，如骨骼、韌帶、皮膚、軟骨等，約占總蛋白質的25%～35%[1-2]。膠原蛋白的氨基酸組成因來源和蛋白質類型不同而有所差異[3]，但大致的氨基酸組成相同,羥脯氨酸是膠原蛋白特有氨基酸，用羥脯氨酸的量乘以相對應的換算系數就得到膠原蛋白的含量[4]。近年來，市面上的膠原蛋白產品琳瑯滿目，膠原蛋白在乳制品方面應用的也很廣，乳制品中蛋白的檢測主要方法是國標的凱氏定氮法，但是對于乳制品中膠原蛋白的檢測還未有標準，因此根據市場的需求研究開發一種膠原蛋白的檢測方法是具有十分重要的意義。

1 膠原蛋白

1.1 膠原蛋白的種類

目前已發現27種不同類型的膠原蛋白,依照發現的先后順序采用羅馬數字命名為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白等，其中含量最多的以Ⅰ型膠原蛋白為主，占全部膠原蛋白含量的90%以上[5-6]。按構成組織可分為纖維狀膠原、軟骨質膠原、玻璃狀膠原、彈性膠原等[7]。根據在體內的功能和散布特點,可將膠原蛋白分成間質膠原、基底膜膠原、細胞外周膠原。

1.2 膠原蛋白的來源

膠原蛋白的來源很多，以前主要來源于豬、牛的皮和骨骼等。但由于瘋牛病、口蹄疫爆發，開始采用魚的骨、鱗、皮作為制備膠原蛋白的主要原料[8-10]。人們也開始從其他加工副產物中提取膠原蛋白，如Cli?che J[11]利用胃蛋白酶對雞皮進行消化處理得到膠原蛋白，結果可以獲得純度為74.4%的Ⅰ型膠原蛋白。李小勇等人按GB9695.23-90《肉和肉制品中L(-)-羥脯氨酸含量測定》從豬肺中提取出HYP，通過轉換系數最后得出膠原蛋白含量在3.0%～3.2%之間。

1.3 膠原蛋白的應用

膠原蛋白可用于純牛奶、酸奶、中性奶飲料等液態乳制品中，不但保持原有的各種生理功能，還對乳制品品質有一定的改善作用[12]。在褐色乳飲料中添加膠原蛋白具有乳化穩定、提高口感和改善風味的作用。Riichiro O[13]在保健品中加入了膠原蛋白，能非常有效地增加皮膚組織細胞的儲水能力，加強和維持肌膚良好的彈性、增加肌膚的韌性、延緩肌體的衰老。膠原蛋白具有良好的生物學特性，可用于組織修復、創傷、燒傷等醫學領域[14-15]，如Rafiuddin M等人[16]通過膠原蛋白研制成的交聯管狀神經導管成功實現了神經再生。膠原蛋白同樣也具有生物相溶性、生物降解性、細胞適應性、細胞增殖作用及促進血小板凝聚等生物學性質[17]。

2 膠原蛋白檢測方法的國內外研究現狀

2.1 分光光度法

分光光度法是利用物質對某種光的波長具有選擇性吸收的特性，來對物質本身進行定性以及定量分析的方法。此方法應用范圍廣泛，對實驗室儀器設備要求較低，可以在普通實驗室和企業應用，但是特異性、靈敏度和準確性相對較差，測量結果也容易受多種因素的影響。Heng-bin G[18]用分光光度法檢測魚皮中膠原蛋白的含量，結果表明不同魚皮的膠原蛋白含量不同。此方法可以用來測定魚皮中膠原蛋白含量，以便于魚皮中膠原蛋白的進一步開發和利用。Lins[19]依據膠原蛋白水解的游離氨基酸中特有的HYP，測定其含量以計算膠原蛋白的含量，但其水解和衍生過程繁瑣且HYP含量隨生長期不斷變化，所以不是所有來源的膠原蛋白都有確定的轉換系數。張笑通過分光光度儀對乳制品中的羥脯氨酸含量進行測定，從而得知乳制品中是否添加了水解蛋白。

2.2 液相色譜法

高效液相色譜在實驗室已越來越普及，具有靈敏度高、重現性好，適用樣品范圍廣等特點，但是樣品需要衍生，步驟繁瑣易造成衍生不完全的情況發生。Nagai T[20]等人為提高水產品中膠原蛋白的利用率，采取柱前衍生-高效液相色譜法對鯽魚不同組織中的L-羥脯氨酸含量進行檢測，此方法可應用于不同水產品的組織中膠原蛋白的定量分析。Green GD[21]從膠原蛋白的組織提取物或溶液中測定羥脯氨酸的含量，最后得到膠原蛋白的濃度。Hu H等[22]為了區分醬油中是否添加酸水解蛋白液，通過液相色譜法檢測醬油樣品中HYP含量，在波長360 nm下檢測，HYP的峰面積和質量濃度在10～320 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數為0.9992，回收率為97.2%～110.2%，LOD為2.5 mg/L。因此得出，如果在醬油中檢測有HYP的存在，說明在醬油樣品中添加了水解植物蛋白或水解動物蛋白。高效液相色譜法同樣也適用于乳及乳制品中羥脯氨酸的檢測，姜維等將乳制品中的膠原蛋白水解成HYP等氨基酸混合物，測定混合氨基酸中HYP的含量。

2.3 電泳法

該方法要求羥脯氨酸在柱前具有電活性，所以需將L-羥脯氨酸衍生，使其帶有一定的電荷，再進行檢測。適用于膠原蛋白種類的分析分離技術，具有進樣量少、分辨率高、絕對靈敏度高的優點，但是操作較為繁瑣。Mazorra-Manzano MA等[23]實驗研究開發一種通過毛細管電泳（CE）測定肉制品中羥脯氨酸含量的方法，從而得出膠原蛋白的量。Qiu H[24]等利用凝膠電泳法研究了C射線外照射對皮膚等組織中膠原代謝指標的影響,利用該方法分離出分子量相近的膠原蛋白的含量。ONOUMA等[25]利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定黃鰭金槍魚魚鰾膠原蛋白的分子量，進而推測膠原蛋白的含量。Liang等[26]以磷酸鹽作為緩沖液，采用電泳法測定尿液中的HYP，濃度在1.3～262.0mg/L范圍內線性良好，回收率為96.4%～101.2%，HYP的LOD為0.5mg/L。

2.4 氨基酸自動分析儀法

該方法樣品處理操作簡單，誤差小和自動化程度高，能準確、快速地檢測出膠原蛋白水解物中L-羥脯氨酸的含量，又可同時測定出其他16種水解氨基酸，但是此方法成本相對較高，分析耗時太長，所以在基層實驗室不好普及。PRABJEET等[27]用氨基酸自動分析儀分析了巴丁魚皮中提取的酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的氨基酸組成，從而得知L-羥脯氨酸的含量。Johnson RG[28]快速、準確地測定糖胺聚糖(GAG)和膠原蛋白含量，分析了膠原蛋白結締組織類型，從羥脯氨酸和羥賴氨酸值比計算膠原蛋白含量和測定膠原蛋白類型。Cai M等[29]運用氨基酸自動分析儀快速測定牛乳中L-羥脯氨酸的方法，濃度0.05～1.0mmol/L范圍內吸收度呈良好線性關系，平均回收率為91.5%，方法精密度為1.3%，最低檢出限0.66 mg/L。Messia等[30]報道了利用氨基酸自動分析儀測定豬肉及豬肉制品中HYP的含量，方法回收率為97%～104%，RSD小于6.4%，此方法也可用于乳及乳制品中HYP的檢測，最后得出動物水解蛋白含量。氨基酸自動分析儀法同樣適用于乳與乳制品中是否添加動物膠原水解蛋白的鑒定，如曾暖茜等利用氨基酸自動分析儀準確地測定乳制品中HYP含量，張秀堯將乳制品酸水解后直接用氨基酸自動分析儀檢測。

2.5 質譜檢測法

此方法流動相簡單，分析時間短且無需衍生處理，抗干擾能力強，能準確快速地測定膠原蛋白的含量，但是儀器設備昂貴，檢測成本相對較高。Zheng YF等[31]通過高效液相色譜——質譜聯用測定乳制品中是否摻加了膠原蛋白，可用于質量監督部門的乳制品質量安全監督檢驗。Nimptsch A等[32]基于質譜法是利用酶法將膠原蛋白酶解成多肽片段，Gly-Pro-Hyp是膠原蛋白特異性肽段，對膠原蛋白進行定量分析。Colgravea等[33]用質譜檢測法測定綿羊半膜肌中的HYP含量，HYP的濃度在4.9～5000 nmol/L范圍內線性良好，回收率在90%～108%之間，其LOD為640 mg/L，從而得出綿羊半膜肌中膠原蛋白的含量。質譜檢測法被劉思潔等人制訂為吉林省地方標準（乳與乳制品中羥脯氨酸的測定DB S22/010-2012），對乳與乳制品中HYP進行檢測。

2.6 離子色譜法

離子色譜法有分析速度快、樣品用量少、多組分同時分析等優點，但是定性分析能力相對較差，不適合乳與乳制品中膠原蛋白的分析。Avery NC[34]實驗研究利用離子色譜法測定膠原蛋白的含量，證明膠原蛋白具有一定的支撐作用。Yiping Z等[35]人利用離子色譜法測定魚鱗膠原蛋白中L-羥脯氨酸的含量，為工藝研究提供檢測理論依據，同時可作為判斷魚鱗膠原蛋白含量的一個定量指標。

2.7 免疫學檢測法

免疫學檢測法的原理是通過抗原和抗體特異性結合后出現的各種現象，借助電子顯微鏡觀察其結果，來對樣品進行定性及定量檢測。免疫學檢測法包括多種：如酶聯免疫檢測法、免疫電鏡法、放射免疫法、PV法[36]、免疫熒光法、免疫印跡法、ELISA間接法測定Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、雙抗體夾心ELISA法測定血清Ⅳ型膠原蛋白。其中ELISA檢測法比較常用，是將膠原蛋白作為抗原與抗體結合再與辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase,HRP）或堿性磷酸酶（Al?kaline phosphatase，AKP）偶聯的抗體結合，經化學顯色反應，檢測顯色底物的吸光度值即可確定膠原蛋白的相對含量，但其每一步都需洗滌，過程較長并不適于組織分析[37]。

2.8 天狼星紅法

天狼星紅法是通過天狼星紅可以與膠原蛋白發生特異性結合，經過NaoH溶液對其進行洗脫和離心，得到紅色復合物，通過分光光度儀測定吸光度從而確定膠原蛋白含量。Pilar等[38]通過天狼星紅法評估組織中膠原蛋白含量，該方法是基于Sirius紅與固定在PVDF膜上的樣品中存在的膠原蛋白的結合，并且通過掃描儀和圖像分析軟件確定膠原蛋白含量。此方法需要無氧介質或昂貴的設備和大樣本的要求，不適合乳與乳制品中水解膠原蛋白和組織分析。

2.9 傳統的干重法

傳統的干重法是將原料進行一系列加工處理，從中提取出雜膠原蛋白，經凍干得到膠原蛋白，最后測干重分數，過程非常繁瑣且靈敏度相對較低[39-40]，不適合乳與乳制品中膠原蛋白的檢測分析。

3 結束語

近年來，許多研究人員對膠原蛋白的檢測做了深入細致的研究，總結出許多不同的方法，每種方法都有其優點和缺點，現有檢測乳與乳制品中膠原蛋白的方法都需要一定的儀器設備，難以滿足現場進行快速檢測，因此將來需要研制出更加快捷、準確，經濟的檢測手段（如測試片、試紙條等）。目前所采用的主要方法為高效液相色譜法，該方法國內外應用最為廣泛，適用于乳制品及膠原蛋白等產品。檢測膠原蛋白的所有方法都是測定其中L-羥脯氨酸的含量，再乘以相對應膠原蛋白換算系數，最后得出膠原蛋白的總量。對于膠原蛋白中含L-羥脯氨酸的比例系數，不同物種互不相同，即使同種生物不同部位也存在差異，導致沒有一個規范的數值，因此對膠原蛋白換算系數引用混亂。根據相關資料報道：豬骨6.12～6.17、豬皮10左右、雞骨6.27～6.30、羊骨6.34～6.35、牛骨6.77左右、牛皮7.94～8.85、深海魚皮16.67左右、淡水魚皮10.41～11.36、淡水魚鱗12.5左右、鱘魚鰭9.01左右、林蛙皮6.49左右等。所以，尋找更加簡便、準確地膠原蛋白檢測方法應為國內外學者的研究方向。

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