抗菌肽等抑菌物質(zhì)抗菌活性檢測方法比較研究

田娜娜，郭子璇，王璐，李志成

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

0 引 言

抗菌肽抗菌活性測定方法有很多，目前國內(nèi)外學(xué)者多采用擴散法進行抗菌肽活性的檢測[1-5]。擴散法中的打孔法靈敏度高，抑菌圈規(guī)則清晰，效果好，但卻較為耗時[6]。生長在培養(yǎng)基中的菌種接觸到不同的抗菌肽等抑菌物質(zhì)，會形成大小不同的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小，則可以判斷出此種抑菌物質(zhì)的抗菌活性。同理，在菌懸液中加入不同濃度的抗菌肽等抑菌物質(zhì)，根據(jù)其吸光度的大小，可以判斷該物質(zhì)的抗菌活性。抑菌物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用成功地預(yù)防和治療了微生物引起的疾病的傳播，現(xiàn)正在以驚人的速度被添加到家庭的日用品和醫(yī)藥、保健品當(dāng)中[7-8]?？咕淖鳛橐活愐志镔|(zhì)，在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域和畜牧產(chǎn)業(yè)中成為了研究的熱點[9-12]。因此，如何快速而簡便的測定抗菌肽等抑菌物質(zhì)的抗菌活性也就成為一個重要的問題。

本文選取大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌三種常見的菌種，分別采用抑菌圈法和分光光度法對不同濃度的Nisin溶液進行抗菌活性檢測，從而建立了上述兩種方法間的聯(lián)系，為快速而簡便的檢測抗菌肽等抑菌物質(zhì)的抗菌活性提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌（Escherichia coliATCC25922）、沙門氏菌（SalmonellaLT2）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aures26111），西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏；牛肉膏、蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂為生化試劑；乳酸鏈球菌素（Nisin）、茶多酚和聚賴氨酸為食品級；鹽酸、無水乙醇、NaOH和NaCl為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外可見分光光度計，PB-10型數(shù)顯酸度計，SW-CJ-IF超凈工作臺，F(xiàn)1-45恒溫培養(yǎng)箱，SL502N高壓蒸汽滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

參照蘇晉文的方法制作[13]。簡述如下，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，加入5%的NaOH溶液，使其pH為7.4～7.6，于121℃高溫滅菌15 min，備用。固體培養(yǎng)基加入12 g瓊脂。

1.3.2 菌液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在無菌條件下，采用劃線法將甘油保藏的菌種于斜面培養(yǎng)基上連續(xù)活化2次。用接種針勾取活化后的新鮮菌落放入100 mL培養(yǎng)液中，搖勻混合液，放置在37℃下培養(yǎng)24 h，再用無菌培養(yǎng)液將其稀釋至107CFU/mL備用。通過測定大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌液吸光度和菌液濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]，如圖1所示。

圖1 菌液吸光度與其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 抑菌圈法與分光光度法檢測抑菌物質(zhì)的抗菌活性試驗

用無菌水配制質(zhì)量濃度為0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L、1.00 g/L的Nisin溶液[14]，選取大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為試驗菌種，采用抑菌圈法和分光光度法檢測Nisin溶液的抗菌活性，得出抑菌圈直徑比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系。最后配制濃度梯度均為0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L的茶多酚溶液和聚賴氨酸溶液[14]，用相同的方法獲得其抑菌圈直徑比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系。

1.3.3.1 抑菌圈法檢測Nisin溶液的抗菌活性試驗

在無菌條件下，取107CFU/mL菌液100 μL，用玻璃刮板均勻涂布于營養(yǎng)培養(yǎng)基的表面，大約20 min后菌液被吸收，用外徑為8 mm的無菌小鋼管在瓊脂平板上打孔，每孔加入80 μL的Nisin溶液，水平置于4℃冰箱中，待Nisin溶液完全擴散后（約2～3 h后），再移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。每組做3個平行，最后取平均值。以等量的0.85%（g/mL）生理鹽水作陰性對照組，以等量的0.64 mg/mL青霉素鈉作陽性對照。當(dāng)樣品出現(xiàn)抑菌圈，以游標(biāo)卡尺量取其抑菌圈的直徑，直徑的大小代表其抑菌活性的大小[15]。

抑菌圈直徑比按照公式（1）計算：

1.3.3.2 分光光度法檢測Nisin溶液的抗菌活性試驗

參考尹寧、潘曉倩[6,16]的方法，略作修改。分別取活化后菌液濃度為107CFU/mL的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌液10 mL，加到10 mL 0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L和1.00 g/L的Nisin溶液中。在陰性對照組中分別加入相應(yīng)體積的三種菌液和0.85%（g/mL）的生理鹽水，陽性對照組中分別加入同樣體積的三種菌液和0.64 mg/mL的青霉素鈉溶液，均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在600 nm處測定菌液的吸光度OD600，每組做3個平行，求平均值。

菌液培養(yǎng)前后吸光值的變化：

抑菌率按照公式（2）計算：

2 結(jié)果分析

2.1 Nisin溶液對不同菌種的抑菌效果

目前沒有采用抑菌圈法檢測抑菌物質(zhì)抗菌活性的國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加在瓊脂孔內(nèi)或紙片上樣品量50～1000 μL不等[17-19]，瓊脂孔或紙片的直徑大小不一，5～15 mm均有[20-22]，這樣，僅用抑菌圈的直徑比較抑菌物質(zhì)的抗菌活性顯得不夠嚴(yán)謹(jǐn)。因此，提出用抑菌圈直徑比代替抑菌圈直徑表示抑菌圈法測定抑菌物質(zhì)的抗菌活性。

表1 Nisin對不同菌種抑菌圈直徑比的影響

本試驗比較了不同質(zhì)量濃度Nisin對三種菌種抑制作用形成的抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比的大小。Nisin對不同菌種抑菌活性的影響見表1。由表1可知，對于大腸桿菌和沙門氏菌，隨著Nisin溶液濃度的增加，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比也逐漸增加。對于金黃色葡萄球菌，Nisin溶液濃度在0.20～0.60 g/L時，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比隨著Nisin濃度的增加而增加，Nisin溶液濃度在0.60～1.00 g/L時，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比的變化不大，這與李金春等研究Nisin對金黃色葡萄球菌的致死作用中的結(jié)果基本一致[23]，即Nisin的濃度范圍在0～0.4 g/L，隨著Nisin濃度的增加，對金黃色葡萄球菌的致死量顯著增加，Nisin濃度超過0.4 g/L，金黃色葡萄球菌致死量變化趨于平穩(wěn)。對于這三種菌種，Nisin對金黃色葡萄球菌的抑制作用最小，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比最小。

根據(jù)潘曉倩等的研究[6]，與本試驗相比，加在瓊脂孔內(nèi)樣品量不等，瓊脂孔的直徑均為8 mm，形成的抑菌圈直徑不同，得出的抑菌圈直徑比也不同，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是所用Nisin溶液的活性不同。

2.2 不同菌種抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系

2.2.1 大腸桿菌

圖2 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（大腸桿菌）

由圖2可以看出，隨著抑菌率的增加，抑菌圈直徑比也按照一定比例增加。對于大腸桿菌，檢測不同濃度Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法和分光光度法之間存在指數(shù)關(guān)系，關(guān)系式為y=1.6329e0.0015x。分別檢測茶多酚溶液和聚賴氨酸溶液對大腸桿菌的抑菌效果，見圖3。由圖3可知，茶多酚和聚賴氨酸對大腸桿菌的抑菌率和抑菌圈直徑比的關(guān)系均為二次多項式關(guān)系。根據(jù)以上關(guān)系式可以反推其抑菌圈直徑比和抑菌圈的直徑。例如當(dāng)Nisin、茶多酚和聚賴氨酸對大腸桿菌的抑菌率均為80%時，代入公式y(tǒng)=1.6329e0.0015x、y=0.0087x2-1.4783x+64.8和y=0.0003x2-0.0301x+2.5936中，可以得到抑菌圈直徑比分別為1.841、2.216和2.1056，若瓊脂孔或紙片的孔徑直徑為8 mm，那么可得出抑菌圈直徑分別為14.728 mm、17.728 mm和16.845 mm。

圖3 茶多酚和聚賴氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（大腸桿菌）

2.2.2 沙門氏菌

圖4 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（沙門氏菌）

由圖4可知，Nisin對沙門氏菌的抑菌率在40%～70%的范圍內(nèi)增加時，其抑菌圈直徑比快速增大，此后抑菌圈直徑比隨抑菌率的增加而緩慢增加。對于沙門氏菌，加入不同濃度Nisin溶液，其抑菌圈法所得到的直徑比與分光光度法得到的抑菌率之間存在三次多項式的關(guān)系，關(guān)系式為y=0.000003x3-0.0007x2+0.0638x+0.0126。分別檢測茶多酚溶液和聚賴氨酸溶液對沙門氏菌的抑菌效果，見圖5。由圖4和圖5可知，隨著Nisin、茶多酚和聚賴氨酸對沙門氏菌抑菌率的增加，抑菌圈直徑比呈增加趨勢，存在多項式關(guān)系。當(dāng)Nisin、茶多酚和聚賴氨酸對沙門氏菌的抑菌率分別為70%、95%和50%，此時的抑菌率直徑比分別為2.0776、2.2559和1.8327。

圖5 茶多酚和聚賴氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（沙門氏菌）

2.2.3 金黃色葡萄球菌

圖6 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（金黃色葡萄球菌）

由圖6知，抑菌圈直徑比隨著抑菌率的增加而增加。當(dāng)抑菌率小于40%，抑菌圈直徑比的增加緩慢；當(dāng)抑菌率大于40%，抑菌圈直徑比隨抑菌率的增加而上升較快。在不同濃度Nisin溶液對金黃色葡萄球菌的抑制試驗中，抑菌圈直徑比與抑菌率之間存在二次多項式關(guān)系，關(guān)系式為y=0.00008x2-0.003x+1.0526。分別檢測茶多酚溶液和聚賴氨酸溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，見圖7。由圖6和圖7可知，對于金黃色葡萄球菌，Nisin、茶多酚和聚賴氨酸對其抑制所形成的抑菌率和抑菌圈直徑比的關(guān)系分別為二次多項式、線性和二次多項式關(guān)系，并且隨著抑菌率的增加，抑菌圈直徑比呈現(xiàn)出上升的趨勢。在錢麗紅[24]等的研究中測得2 g/L的茶多酚對金黃色葡萄球菌的抑菌率為45.2%，代入茶多酚對金黃色葡萄球菌的抑菌率和抑菌圈直徑比的公式y(tǒng)=0.0101x+0.5189中，可得到抑菌圈直徑比為0.9754，進而可得到不同孔徑下的抑菌圈直徑。

圖7 茶多酚和聚賴氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（金黃色葡萄球菌）

因此，對于確定的菌種來說，通過建立某抑菌物質(zhì)的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系，可以用分光光度法快速而簡便的測定某抑菌物質(zhì)的抗菌活性。

3 結(jié)論

不同濃度的Nisin溶液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，其抑菌圈直徑比與其抑菌率之間分別存在指數(shù)、三次多項式和二次多項式關(guān)系。Nisin溶液對不同菌種抑菌效果的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系不同，但對于同一菌種，Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系是確定的。經(jīng)驗證，茶多酚和聚賴氨酸同樣適用以上規(guī)則。對于確定的菌種來說，通過建立某抑菌物質(zhì)的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系，就可以用分光光度法快速而簡便的測定某抑菌物質(zhì)的抗菌活性。本文首次建立起抑菌圈法與分光光度法的聯(lián)系，提供了一種測定抑菌物質(zhì)抗菌活性的新思路，可以通過較為簡單的操作得到更為直觀、可信的結(jié)果。

本試驗主要對常見的大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌進行驗證，抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系是否可應(yīng)用于其他菌種仍有待進一步的驗證。

[1]鄔曉勇,何鋼,顏軍,等.蛙皮抗菌肽活性檢測方法的篩選及其分離純化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,24(4):1564-1567.

[2]ZOHRI M,ALAVIDJEH M S,HARIRIAN I,et al.A Comparative Study Between the Antibacterial Effect of Nisin and Nisin-Loaded Chitosan/Alginate Nanoparticles on the Growth of Staphylococcus au?reus,in Raw and Pasteurized Milk Samples[J].Probiotics&Antimicro?bial Proteins,2010,2(4):258-266.

[3]PONGTHARANGKUL T,DEMIRCI A.Evaluation of agar diffu?sion bioassay for nisin quantification[J].Applied microbiology and bio?technology,2004,65(3):268-272.

[4]TURCOTTE C,LACROIX C,KHEADR E,et al.A rapid turbido?metric microplate bioassay for accurate quantification of lactic acid bac?teria bacteriocins[J].International Journal of Food Microbiology,2004,90(3):283-93.

[5]熊清權(quán),李志成,童偉,等.牛乳酪蛋白酶解物的分離純化及抗菌肽乳基料的制備研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,41(1):200-206.

[6]潘曉倩,成曉瑜,張順亮,等.不同檢測方法在抗菌肽抑菌效果評價的比較研究[J].肉類研究,2014(12):17-20.

[7]唐立,陳紅.警惕日用品中添加抗菌物質(zhì)給我們生活帶來的影響—干擾正常菌群[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2002,14(3):179-180.

[8]PETERS B M,SHIRTLIFF M E,JABRARIZK M A.Antimicrobial Peptides:Primeval Molecules or Future Drugs[J].Plos Pathogens,2010,6(10):e1001067.

[9]ZHANG J X,ZHANG S F,WANG T D,et al.Mammary gland ex?pression of antibacterial peptide genes to inhibit bacterial pathogens causing mastitis.[J].Journal of Dairy Science,2007,90(11):5218-5225.

[10]黎觀紅,洪智敏,賈永杰,等.抗菌肽的抗菌作用及其機制[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2011,23(4):546-555.

[11]梁英.抗菌肽的來源及應(yīng)用[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2014,26(1):7-16.

[12]KEYMANESH K,SOLTANI S,SARDARI S.Application of anti?microbial peptides in agriculture and food industry[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(6):933-944.

[13]蘇晉文,李志成,任嬌,等.山羊乳酪蛋白酶解條件優(yōu)化及其抗菌活性研究[J].中國乳品工業(yè),2014,42(5):4-8.

[14]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2015

[15]曾維才,譚敏,張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評價方面的比較[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2010,27(3):112-117.

[16]尹寧.補料分批發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽及其抑菌性能研究[D].陜西科技大學(xué),2016.

[17]孫夢桐,林洋,馬歡歡,等.Nisin、山梨酸鉀復(fù)合抑制尹家雞翅中腐敗菌的研究[J].食品研究與開發(fā),2017,38(16).

[18]周佳.腸球菌素SAU-2的純化和特性研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[19]張百剛,高華,鐘旭美.生物抑菌素Nisin抑菌試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(9):128-130.

[20]張國只,陳林海,楊天佑,等.瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2007,28(3):175-178.

[21]吳瓊.乳鏈菌肽效價測定方法的研究[J].食品科學(xué),1999,20(6):56-59.

[22]張國只,陳林海,王利敏,等.溫度對瓊脂擴散法測定Nisin效價的影響[J].食品工業(yè)科技,2006(11):177-178.

[23]李金春,楊君娜,周彤,等.營養(yǎng)肉湯中金黃色葡萄球菌致死模型的構(gòu)建[J].中國食品學(xué)報,2017,17(2):235-242.

[24]錢麗紅,陶妍,謝晶.茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理[J].微生物學(xué)通報,2010,37(11):1628-1633.