甲苯咪唑對黃河鯉過氧化氫酶活性的影響

郭國軍+弓飛龍+唐國盤+徐文彥+秦改曉+齊子鑫

摘要：為探討甲苯咪唑對鯉魚的致毒機理，采用靜態水質接觸染毒法，研究在不同暴露濃度（0、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/L甲苯咪唑）和不同暴露時間（24、72、120、168 h）下甲苯咪唑對黃河鯉（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel） 鰓、肝胰臟和腎臟里過氧化氫酶活性的影響。結果顯示，甲苯咪唑對鯉魚過氧化氫酶活性具有明顯的誘導作用，呈現一定的劑量效應與時間效應，且隨濃度的升高和時間的延長，過氧化氫酶活性呈先升高、后降低的變化趨勢，特別是在暴露于甲苯咪唑72 h后，各處理濃度對黃河鯉鰓、肝胰臟和腎臟里過氧化氫酶活性的影響均達極顯著水平。甲苯咪唑引起黃河鯉中毒的主要靶分子可能是過氧化氫酶，過氧化氫酶活性可作為鯉魚甲苯咪唑中毒的指示指標。

關鍵詞：黃河鯉（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel）；甲苯咪唑；過氧化氫酶活性；鰓；肝胰臟；腎臟

中圖分類號：S965.116：S859.79+5：Q554+.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4830-03

黃河鯉（Cyprinus carpio L.var.haematopterus Temminck et Schlegel）是河南省一個重要的水產養殖對象，是河南省漁業產業的支柱之一。近年來，隨著黃河鯉養殖規模持續擴大，養殖密度不斷提高和養殖環境日益惡化，養殖病害的頻繁發生給養殖產業帶來了嚴重的經濟下滑。為了降低病害對黃河鯉養殖造成的損失，甲苯咪唑往往被用于治療黃河鯉的指環蟲、三代蟲等單殖吸蟲類寄生蟲病。然而，甲苯咪唑的過量使用也會對養殖水體造成污染，從而對黃河鯉產生毒害作用。目前有關甲苯咪唑對魚類的毒理作用報道很少，而且主要集中在半致死濃度、體內藥物代謝及殘留消除的研究上[1-5]，尤其是對黃河鯉的研究甚少。過氧化氫酶（Catalase，CAT）是動物、植物以及微生物機體防御體系的關鍵酶之一，機體的內外環境變化可引起細胞代謝產生過氧化氫，過氧化氫是強氧化劑，對細胞有一定的毒害作用，過氧化氫酶的存在可以及時清除細胞產生的過氧化氫，保護細胞免受過氧化物的毒害而應對環境變化。試驗通過測定經不同濃度甲苯咪唑浸泡的黃河鯉鰓組織、肝胰臟、腎臟中的CAT活性，探索了黃河鯉抗氧化防御體系對甲苯咪唑引起毒性效應的應答特性，以期了解黃河鯉對甲苯咪唑的抗毒機理，為黃河鯉集約化養殖生產和水質的評價、檢測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試動物

試驗使用的黃河鯉來源于鄭州市漁場，其體重為40.4 g±1.86 g，體長12 cm±2 cm。先將經曝氣處理后的自來水注入水族箱中，隨后把黃河鯉置于水族箱中養殖，試驗期間不投食。水質條件如下：pH 6.8～7.4，溶氧6～10 mg/L，水溫13～15 ℃，總硬度為715（德國硬度），其他指標符合文獻[6]的要求。

1.2 儀器與試劑

儀器主要有752紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、Anke TDL-5-A臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、FA1604N電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；玻璃勻漿器、1 cm石英比色皿、秒表、注射器（5 mL）以及解剖工具（各種類型鑷子、剪子和不銹鋼手術刀）。試劑主要有甲苯咪唑（廣東利建制藥有限公司）；甲酸（上海試劑一廠）； CAT試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 試驗設計與采樣

根據課題組已經發表的甲苯咪唑對黃河鯉魚急性毒性試驗結果[1]，設定1個空白對照組和4個染毒處理組，甲苯咪唑液的制備是將0.10 g甲苯咪唑溶于1 mL甲酸，然后用去離子水稀釋至試驗所用甲苯咪唑濃度，分別為0.10、0.20、0.40、0.60 mg/L，每組3個水族箱，每箱放黃河鯉15尾，試驗采用水質接觸染毒法，試驗期間不更換試液。

在含有不同濃度甲苯咪唑稀釋液水體的水族箱中，黃河鯉分別浸泡24、72、120、168 h后，從每箱中隨機選取3尾，迅速解剖，剪取鰓、肝胰臟和腎，用預冷的去離子水沖洗干凈，濾紙吸干后裝袋密封，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.4 樣品處理

各組織樣品在4 ℃下解凍，迅速剪碎，按1∶9加入預冷生理鹽水（0.67%），玻璃勻漿管中勻漿5 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，再用生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿液。

1.5 CAT活性測定

樣品的組織蛋白和CAT 活性的測定均采用南京建成生物科技有限公司試劑盒測定。CAT活性定義為：每毫克組織蛋白酶分解1 μmol H2O2的量為1個酶活性單位。

1.6 數據處理

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2010程序處理，并用其制圖；運用SPSS 19.0統計軟件進行數據統計分析，描述性統計值采用平均值±標準差（x±SD）表示，以0.05為統計檢驗水平，通過單因素方差分析進行組間差異的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 甲苯咪唑對黃河鯉鰓組織CAT活性的影響

甲苯咪唑對黃河鯉鰓組織CAT活性的影響情況見圖1。由圖1可知，各染毒處理組的鰓組織CAT活性都高于對照組，并且隨著甲苯咪唑濃度的升高，鰓組織CAT活性呈現出先增大后減少的變化趨勢，當濃度為0.20 mg/L時達到最大。用這個濃度處理24、72、120、168 h后，與對照組相比，鰓組織CAT活性分別提高了5.18%、5.54%、4.19%、3.81%，其中72 h后大大高于對照組，24、120 h后明顯高于對照組，而168 h后與對照組相比，鰓組織CAT活性無明顯變化。隨著染毒時間延長，各處理組鰓組織CAT活性也呈現出先增大后減少的變化趨勢，且染毒時間為72 h時達到最大。與對照組相比，4個染毒處理組在72 h時鰓組織CAT活性分別提高了4.73%、4.53%、4.53%、2.10%，其中0.10、0.20 mg/L染毒處理組大大高于對照組，0.40 mg/L染毒處理組明顯高于對照組，而0.60 mg/L染毒處理組與對照組相比，鰓組織CAT活性無明顯變化。endprint

2.2 甲苯咪唑對黃河鯉肝胰臟CAT活性的影響

甲苯咪唑對黃河鯉肝胰臟CAT活性的影響情況見圖2。由圖2可知，暴露于不同濃度甲苯咪唑水體中的黃河鯉肝胰臟CAT活性變化規律與鰓組織CAT活性變化規律相似，CAT活性也是呈現出先增大后減少的變化趨勢，其中24 h后0.20 mg/L染毒處理組和72 h后各染毒濃度處理組CAT活性與對照組相比，均大大提高，分別提高了4.21%、6.53%、6.60%、6.88%、5.68%；24 h后0.10、0.40 mg/L染毒處理組和120 h后0.20 mg/L染毒處理組CAT活性與對照組相比，均明顯提高，分別提高了3.49%、5.26%、3.36%，而其他各染毒處理黃河鯉肝胰臟CAT活性與對照組相比均無明顯變化。

2.3 甲苯咪唑對黃河鯉腎臟CAT活性的影響

甲苯咪唑對黃河鯉腎臟CAT活性的影響情況見圖3，由圖3可知，暴露于不同濃度甲苯咪唑水體中的黃河鯉腎臟CAT活性變化規律與肝胰臟CAT活性變化規律相似，CAT活性也是呈現出先增大后減少的變化趨勢，與對照組相比，24 h后0.20、0.40、0.60 mg/L染毒處理組和72 h后各染毒處理組黃河鯉腎臟CAT活性均大大提高，分別提高了6.78%、7.42%、6.78%、7.81%、8.66%、8.87%、7.95%，24 h后0.10 mg/L和120 h后0.20 mg/L染毒處理組黃河鯉腎臟CAT活性呈明顯提高，分別提高了5.58%、4.28%，而其他各染毒處理黃河鯉腎臟CAT活性與對照組相比均無明顯變化。

3 小結與討論

魚類對水體中的毒物較為敏感，鰓組織是魚體吸收毒物的主要部位，肝胰臟和腎臟是魚體吸收毒物后的主要解毒和排毒器官，因此通過研究毒物接觸后魚鰓、肝胰臟、腎臟中酶活性的變化，可以指示水體的毒物污染程度，并可預測毒物對水生生態系統的影響。CAT是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，其功能是催化細胞內的過氧化氫分解，防止膜脂過氧化的發生，其中最主要的就是參與活性氧代謝過程。在環境脅迫等逆境情況下，生物體內廣泛存在活性氧爆發現象，導致自由基增多，使細胞膜產生過氧化，細胞膜被破壞和損傷。在活性氧代謝過程中，CAT可以使H2O2發生歧化生成水和氧分子，與SOD、POD共同組成了生物體內活性氧防御系統，在清除超氧自由基、H202和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發揮著重要的作用[7]。賈秀英等[8]、成嘉等[9]分別研究了水中鎘離子和鉛離子等重金屬對水生動物組織CAT活性的影響，徐境波等[10]、陳家長等[11]、羅朝軍等[12]、黎東怡等[13]分別研究了硝基芳烴、除草劑阿特拉津、農藥三唑磷、重鉻酸鉀等有機化合物對不同魚類組織CAT活性的影響，結果表明，隨重金屬離子、有機物濃度、接觸時間的不同，CAT活性呈現一定的劑量效應與時間效應，對不同水生動物CAT活性表現出明顯的誘導作用，且隨時間延長和濃度的升高呈先升高、后降低的變化趨勢。本試驗同樣表明甲苯咪唑對黃河鯉CAT活性具有明顯的誘導作用，呈現出一定的劑量效應與時間效應，且隨濃度的升高和時間延長，CAT活性呈先升高、后降低的變化趨勢，特別是在染毒甲苯咪唑72 h后，各染毒處理濃度對黃河鯉的鰓、肝胰臟和腎臟CAT活性影響均達到較高水平，表明甲苯咪唑在一定的濃度范圍內，對黃河鯉具有一定的生理調節機能；黃河鯉CAT活性對有毒物質脅迫的敏感性，可以作為水生生態系統中有毒物質的生物監測指標。

試驗結果表明，處理組隨染毒時間延長，黃河鯉3種組織器官中CAT活性呈現先升高后降低的變化趨勢，這表明在一定濃度范圍內，短時間內甲苯咪唑對黃河鯉組織中CAT活性有一定的誘導作用，這可能是黃河鯉中毒的先兆；但隨著染毒時間的延長，CAT活性又出現一定程度的降低，可能是甲苯咪唑的毒性作用在加強，因此，CAT活性可作為甲苯咪唑中毒指示指標；同時也表明甲苯咪唑引起黃河鯉中毒的主要靶分子可能就是CAT。

參考文獻：

[1] 徐文彥，郭國軍，齊子鑫，等.阿維菌素和甲苯咪唑對黃河鯉的急性毒性研究[J].淡水漁業，2011，41（2）：88-91.

[2] 張新鋮，朱新平，劉毅輝，等.甲苯咪唑、溴氰菊酯和硫酸銅對美洲鰣的急性毒性研究[J].南方水產科學，2015，11（2）：66-71.

[3] 郭東方，劉永濤，艾曉輝，等.甲苯咪唑在銀鯽體內的藥代動力學研究[J].中國水產科學，2009，16（3）：434-441.

[4] 胥 寧，劉永濤，艾曉輝，等.甲苯咪唑在團頭魴體內主要代謝物及其變化規律研究[J].淡水漁業，2013，43（6）：39-44.

[5] 潘 浩，王 荻，盧彤巖.甲苯咪唑在鯽體內的藥動力學[J].水產學雜志，2016，29（4）：38-42.

[6] GB11607-89，漁業水質標準[S].

[7] 劉 冰，梁嬋娟.生物過氧化氫酶研究進展[J].中國農學通報，2005，21（5）：223-225.

[8] 賈秀英，董愛華，施農農.鎘對鯽魚組織過氧化氫酶活性的影響[J].上海環境科學，2000，19（8）：394-395.

[9] 成 嘉，符貴紅.重金屬鉛對鯽魚乳酸脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響[J].生命科學研究，2006，10（4）：372-376.

[10] 徐境波，景體淞. M-DNB和P-DNB對鯉魚肝臟過氧化氫酶的影響[J].中國環境科學，1998，18（1）：57-59.

[11] 陳家長，孟順龍，胡庚東，等.低濃度阿特拉津對鯽魚過氧化氫酶（CAT）活性的影響[J].農業環境科學學報，2008，27（3）：1151-1156.

[12] 羅朝軍，黃 煜.三唑磷農藥對鯽魚肝臟過氧化氫酶活性的影響[J].安徽農業科學，2007，35（36）：11867-11868，12019.

[13] 黎東怡，杜青平，屈嘉儀，等.重鉻酸鉀對斑馬魚的急性毒性及組織過氧化氫酶活性的影響[J].廣東科技，2014（2）：68-69.endprint