梨樹PyS6PDH2基因的克隆及其在不同樹形條件下的表達分析

劉政+林世華+安莉園+秦仲麒+伍濤+李先明+涂俊凡+楊夫臣+朱紅艷+楊立

摘要：山梨醇是梨樹等薔薇科植物光合作用初級轉運產物。6-磷酸山梨醇脫氫酶（S6PDH）是山梨醇合成過程中的關鍵酶，但是其在不同樹形中的調控作用尚未闡明。結果表明，PyS6PDH2基因包含933 bp的開放讀碼框，編碼310個氨基酸，分子質量為34.9 ku，理論等電點為8.73，具有親水性。PyS6PDH2的氨基酸序列與其他薔薇科植物的S6PDH具有高度的同源性。PyS6PDH2蛋白質二級結構元件包括α-螺旋（42.58%）、β-轉角（9.03%）、延伸鏈（18.39%），和不規則盤繞（30.00%）。表達分析表明PyS6PDH2基因在棚架樹形葉中的表達水平高于疏散分層形，該基因可能是通過促進山梨醇合成從而提高棚架樹形的果實品質。

關鍵詞：梨樹；PyS6PDH2基因；山梨醇合成；樹形；克隆；qRT-PCR

中圖分類號：Q78；S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4902-05

目前中國梨生產面積基本已穩定在112萬hm2左右，產量達到1 869.9萬t。然而現存的老梨園多采用傳統的多主枝疏散分層形，其樹體高大，枝量重疊，樹冠郁閉，病蟲害問題嚴重。隨著中國勞動力成本不斷攀升以及老齡化問題日漸凸顯，許多果園精細化管理水平得不到有效保證，制約了優質果品的生產[1]。因此，發展輕簡化、優質高產整形模式是果園栽培管理的必然趨勢。

光照條件是決定果實品質和產量最重要的關鍵因素之一[2]。良好的樹形結構可以提高光合有效輻射（Photosynthetically active radiation，PAR）在冠層內的滲透和分布，促進光合作用合成產物更有效地從葉（源）向果實（庫）積累，從而提升果實產量和品質[3-5]。此外，整形不僅能夠調節冠層微氣候，通風透光，降低相對濕度，減少病害的發生率[6]，還能夠促進花芽分化，影響葉蒸騰作用，增加果實糖分、花青素以及總酚含量[7]。為了明確整形模式對果實品質的影響，Asadollsh等[8]對5種樹形條件下的“Golden Delicious”蘋果樹營養生長（樹高度、新稍生長量、主干直徑、樹冠擴張量）和果實品質（大小、單果重、硬度、風味、芳香、可溶性固形物、可滴定酸、產量）進行了比較，發現不同的樹體結構明顯影響了果實品質，且細長紡錘形果實產量最高；Pasa等[9]分析了桃的3種樹形，發現“中心領導干”樹形在早期產量和經濟回報上高于其他兩種樹形。

梨樹傳統的樹形多樣，包括疏散分層形、開心形、自然圓頭形、Y字形等。近幾年來，梨棚架栽培模式由于操作管理方便，便于標準化和機械化生產而被廣泛推廣，其光照和通風條件好被認為是果實單果質量高、商品性好的原因[10]。目前本課題組以及國內外同行已從生理水平的角度比較了不同樹形對梨光合作用和果實產量及品質的影響[1，11-14]，然而梨樹樹形調控果實品質的相關基因研究尚未報道。分離并克隆樹形調控光合產物積累的關鍵基因，有望為解析其調控機理提供理論支持。

山梨醇是梨等多種薔薇科木本植物最主要的光合產物，也是向果實運輸最重要的碳水化合物運輸形式和儲藏物質，并與改善果實風味密切相關[15，16]。6-磷酸山梨醇脫氫酶（Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH；EC 1.1.1.200）在山梨醇合成過程中起著催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸山梨醇的作用，其活性伴隨著山梨醇的積累并且在葉片中有較高的表達[17]。研究者在蘋果葉片中克隆了S6PDH基因，發現該基因在子葉中的活性高于其他器官[18，19]。完全成熟的桃葉片中S6PDH基因表達水平以及其的酶活性和蛋白水平均高于幼嫩葉片，表明該基因的表達與葉片源強密切相關[20]。Kim等[21]克隆出了編碼310個氨基酸序列的PyS6PDH基因，其在花后30 d的梨葉片組織高表達，并在之后的時期呈現有波動的下降表達；高溫對PyS6PDH基因表達水平在梨葉中有抑制作用，但是其在果實中表達沒有明顯的影響[22]；提高鉀含量能明顯提高梨葉片和果實的山梨醇及S6PDH基因表達水平[23]。

梨基因組測序工作的完成（http：//peargenome.njau.edu.cn/）能迅速功能基因的挖掘[24]。本研究利用基因組序列信息，克隆出了一個新的S6PDH基因，并對該基因進行了序列分析，采用qRT-PCR技術分析其在不同樹形的葉片組織中的表達模式差異，為進一步解析該基因在整形模式調控光合產物積累過程中的作用提供分子水平上的證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年在湖北省農業科學院果樹茶葉研究所金水基地梨育種試驗園進行。供試材料為八年生的疏散分層形和“雙臂順行式”棚架樹形的圓黃梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. Wonhwang）葉片，兩種樹形的梨樹樹勢相似，施肥、灌溉、病蟲防治等管理水平相對一致。取樣方法參照王少敏等[25]，每株樹從各方向選擇中上部生長一致的枝梢，從頂部下數第5～7片完全展開的功能葉混合成1個樣本池。分別在花后50、80、110、140 d取樣，立即放入液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 總RNA提取、檢測與cDNA合成

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen，China）提取各樣本的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoPhotometerTM Spectrophotometer（IMPLEN，Germany）評價RNA的完整性并檢測其濃度。以總RNA為模板，使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）進行cDNA第一鏈的合成。

1.3 基因的克隆與序列分析endprint