骨骼肌中與運動相關蛋白質組學的研究進展

張海濱 田雪文

運動訓練作為最佳的非藥物學策略，在多種病理生理條件下能夠預防或減輕骨骼肌萎縮及損傷，對機體健康產生積極效應。骨骼肌對收縮刺激具有顯著的可塑性。在不同運動訓練刺激下，骨骼肌分子和形態產生不同適應性，以滿足其功能需求。盡管運動可以促進骨骼肌在收縮特性、線粒體功能和血管生成等方面的重塑，但運動誘導骨骼肌重塑反應的信號通路和分子學機制尚未明確。由于基因僅僅是遺傳物質的載體，同一組基因在不同階段或環境下轉錄翻譯后表達的蛋白質不同，所產生的生理功能不同。隨著后基因時代的發展，蛋白質組在基因組基礎上被提出，蛋白質組學研究開始受到國內外科研工作者的青睞。蛋白質組學是在特定刺激條件下，對單一細胞或組織基因組翻譯后表達的所有蛋白質特質進行分析的科學。基于質譜和生物信息學的蛋白質組學，能夠確定與運動訓練相關的骨骼肌重塑潛在分子標記，綜合觀察運動刺激反應的分子通路，更好的解釋運動訓練對骨骼肌重塑的影響。本文通過綜述蛋白質組學相關技術，及其對運動訓練誘導骨骼肌重塑的影響，以促進蛋白質組學相關技術在運動人體科學領域的應用。

1. 骨骼肌差異蛋白分析的蛋白質組學技術

蛋白質組學能夠分析骨骼肌復雜混合物中的單個蛋白質，因此可以更深入地了解肌肉多樣性和可塑性。然而因肌纖維類型不同、骨骼肌之間異質性以及方法學方面的因素，對骨骼肌進行全面蛋白質組學分析仍存在一定的挑戰。骨骼肌作為高能量需求的重要組織，線粒體無疑成為蛋白質組學研究的重點。骨骼肌釋放的作用于機體局部或全身的分泌蛋白也是蛋白質組學研究的目標。借助差速離心、流式細胞術等分離純化技術提取出骨骼肌或其亞細胞蛋白質組樣品，就可使用基于凝膠或非凝膠方法結合標記或無標記的定量策略進行大規模蛋白質組學研究。蛋白質組學研究主要涉及蛋白質組表達模式和蛋白質組功能模式兩方面的研究，目前大部分集中在蛋白質組表達模式方面。這方面的蛋白質組學相關技術主要指蛋白質分離技術，質譜技術和生物信息學。

1.1 蛋白質組的凝膠分離技術

雙向凝膠電泳技術(2-DE)是分離蛋白質最常用的蛋白質組學技術。其原理是第一向中根據蛋白質在特定PH環境的等電點不同利用等電聚焦分離，在第二向中則按照其分子量不同利用SDS-PAGE分離，將骨骼肌復雜混合物中的單個蛋白質在二維平面上分開。雙向差異凝膠電泳技術(2D-DIGE)是一種熒光標記定量蛋白質組學技術。2D-DIGE是唯一使用內參標志物，并支持在一張凝膠中分離多個樣品且單個成像的蛋白電泳分離技術。該技術基于蛋白質賴氨酸殘基中加入不同熒光的氰化物染料用來標記不同蛋白質組學樣品，隨后利用2-DE技術進行同位素分離保證了樣品所有蛋白質位置的共同移動，從而減少凝膠或凝膠變異產生的潛在錯象。2D-DIGE分離后用胰蛋白酶對存在于凝膠中條帶或斑點酶切以及質譜分析，可鑒定大約3500個蛋白質點，這為深入研究蛋白質組學提供了更多機會。在高強度運動訓練(HIT)誘導骨骼肌適應性的2D-DIGE蛋白質組學分析顯示，鑒定出的800個檢測點和匹配點中，HIT組與久坐組相比有13個蛋白質發生變化。

1.2 蛋白質組的非凝膠分離技術

隨著蛋白質組學研究的深入，突破凝膠電泳中等電點和分子量限制的非凝膠蛋白分離技術，能夠在更廣泛的動態范圍內覆蓋蛋白質組。具有正交分離能力的多維液相色譜法(MDLC)被廣泛使用。最典型的是復合肽混合物通過二維液相色譜(2D-LC)結合強陽離子交換和反相，允許肽借助電荷和疏水性完成分離。將高效液相色譜柱用自動串聯質譜儀鑒定，可有效減少樣品損失量分析出低豐度蛋白質，提高蛋白質組分離成功率。Sollanek等人在運動誘導膈肌表型變化的研究中，使用非標記液相色譜-質譜法對膈肌中分離的可溶性蛋白質和線粒體蛋白質分析顯示，膈肌膜蛋白質總數分別是813和732。耐力運動訓練顯著改變可溶性膜蛋白組中70種蛋白和線粒體蛋白組中25種蛋白質的豐富度。

1.3 蛋白質組學的凝膠液相色譜-質譜技術

為了進一步提高蛋白質組的分離效率，將凝膠和液相色譜結合使用的凝膠液相色譜-質譜技術實現了對蛋白質的多維分離鑒定。其操作流程一般是通過電泳分離蛋白質，切取凝膠中蛋白條帶或斑點，首先進蛋白酶酶切，最后借助液相色譜-質譜(LC-MS/MS )鑒定蛋白質 。同位素的相對與絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術通過2-DE凝膠差異蛋白分析結合1-DE凝膠泳道中胰蛋白酶肽的定量分析，對骨骼肌中多達4或8個樣品多重分析，實現差異蛋白評估。iTRAQ標記是在肽水平上完成的，蛋白質定量則基于離子強度或MS / MS分析后鑒定蛋白質的光譜計數。Holloway 等人采用iTRAQ技術在股外側肌運動訓練干預前后的活檢研究中發現，2-DE解析了256個蛋白質點，配對t檢驗發現了20個表達差異。盡管使用高分辨率質量分析的混合質譜儀對定量蛋白質組學進行了改進，但其高昂的成本費用，標記效率的可變性以及低豐度肽的低分辨率等不同程度局限該技術的廣泛應用。在運動誘導骨骼肌蛋白質組可塑性的表征中獲得的大部分數據來自2-DE研究。

1.4 蛋白質組學數據的生物信息學

蛋白質組學研究的主旨是通過對差異表達蛋白的分離鑒定，描繪出骨骼肌在特定條件刺激下的調節分子通路。蛋白質組學信息學通過對蛋白質組實驗數據的收集和加工，構建雙向電泳圖譜數據庫能夠優化蛋白鑒定；并且輔助分析蛋白質之間的相互作用，構建出機體蛋白質調節網絡。BINGO和ClueGO等生物信息學工具描繪了鑒定出的蛋白質潛在功能和機體生理變化的動態相關性，有助于闡明運動訓練誘導骨骼肌重塑反應的分子學機制。

2. 運動對骨骼肌蛋白質組學的影響

運動對骨骼肌重塑起到了良好的促進作用，運動作為獨立的外界環境應激因素能夠引起骨骼肌產生不同程度的收縮反應。骨骼肌對收縮刺激具有顯著的可塑性，蛋白質組學隨之發生變化。從蛋白質組水平研究骨骼肌在運動適應中的變化，蛋白質組學技術能夠從動態、整體的視角更好的揭示了骨骼肌在運動反應和適應過程中蛋白質組的變化特征。這可能發現新的骨骼肌損傷標記物，對預防骨骼肌損傷具有重要意義。

2.1 有氧運動對蛋白質組學的影響

有氧運動對骨骼肌重塑的促進作用，主要體現在對線粒體能量代謝和細胞膜修復相關蛋白豐度的提高。尹苗苗等人在有氧運動對小鼠骨骼肌蛋白表達影響的研究中發現，蛋白質組學鑒定出6種與線粒體能量代謝、細胞膜修復和糖代謝相關的差異性蛋白表達均成倍上調，這提示有氧運動與骨骼肌重塑密切相關。Kurt等人研究運動誘導膈肌表型變化的結果顯示，耐力運動訓練后幾種關鍵蛋白的豐度相對增加，包括線粒體蛋白18(MTP18)、3-巰基丙酮酸硫酸轉移酶(3MPST)、微粒體谷胱甘肽S-轉移酶3(Mgst3)和熱休克蛋白70kDa蛋白1A / 1B(HSP70)。這些蛋白在幾種細胞類型中具有細胞保護作用，盡管在膈肌纖維中的細胞保護作用尚未完全被闡明，但是暗示了耐力運動預防非活動性肌肉萎縮的功能。Simona等人在研究低強度耐力運動恢復mdx小鼠受損骨骼肌的研究中發現，與久坐mdx小鼠相比，進行鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中有四個蛋白質點顯著改變。經蛋白質組學鑒定為三種碳酸酐酶3(CA3)同系物和超氧化物歧化酶(SODC)。在鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中，CA3亞型的蛋白水平明顯上調，并完全恢復到野生型(WT)小鼠的值。而SODC的蛋白水平顯著下調，并恢復到WT小鼠的值。根據本研究中發現的數據，低強度耐力運動似乎可以通過對抗氧化應激來減少mdx肌肉中的細胞退化過程。另有研究表明，骨骼肌對運動訓練的主要反應是線粒體電子傳遞鏈，三羧酸循環和線粒體呼吸鏈復合物I裝配的蛋白質更豐富。而肥胖/2型糖尿病(T2DM)個體中這三類蛋白質豐度較低，并且耐力訓練的個體骨骼肌更豐富。這提示運動誘導機體防御肥胖和葡萄糖不耐受和T2DM的有害作用主要機制之一發生在電子傳遞鏈的復合物I上。

2.2 無氧運動運動對蛋白質組學的影響

無氧運動引起骨骼肌差異蛋白的數量相對較少。Kym等人，應用定量蛋白質組學研究個體腓腸肌蛋白的水平是否受短時間高強度運動影響時發現，腓腸肌蛋白質水平一般不受短時間高強度運動的急劇影響，雙向凝膠電泳選擇的61個蛋白質點中僅有4中顯著變化。使用液相色譜電噴霧電離-串聯質譜鑒定這些變化的蛋白質為肌酸激酶，肌鈣蛋白，熱休克20kDa蛋白和腺苷酸激酶1的組合。這也表明，大多數個體骨骼肌蛋白質水平不會立即改變，以相應短時間的高強度運動，也提示定量蛋白組學對于檢測骨骼肌蛋白水平的劇烈變化非常敏感。同樣地，Yamaguchi等人研究大鼠進行游泳高強度間歇后骨骼肌適應性變化時發現，蛋白質組學分析顯示，在800個檢測點和匹配點中，與對照組大鼠相比，高強度間歇游泳后大鼠只有13個蛋白質表現出變化。此外，利用western免疫印跡分析，高強度間歇運動對呼吸鏈電子傳遞相關蛋白(NDUFS1)和小清蛋白(parvalbumin ，PV)的表達進行了顯著改變。

3. 總結

綜上所述，運動訓練能夠誘導骨骼肌蛋白質組產生適應性變化。蛋白質組學技術除了檢測差異蛋白質外，更加深入的探討運動誘導的骨骼肌蛋白質組和疾病之間的交流受到越來越多的關注。