福清山羊地方性鼻內腫瘤病毒 綿羊肺炎支原體和溶血性曼氏桿菌混合感染的診斷病例

林裕勝,江錦秀,張靖鵬,游 偉,毛坤明,胡奇林

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所,福建 福州 350013;2.福建省福清市畜牧獸醫技術服務中心,福建 福清 350300)

2017年10月福清市某山羊養殖場發生了以流鼻涕、呼吸困難為主要特征的傳染病,其中1～6月齡小羊病死率高達50%以上。通過臨床癥狀、剖檢病變和實驗室檢驗,確診為山羊地方性鼻內腫瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica,Mh)混合感染引起的山羊呼吸道疾病,診斷過程報告如下。

1 發病情況

福清市某農戶共飼養的福清山羊127只,以山丘放牧為主。2017年5～6月份陸續出現6只1～8月齡左右山羊發病,表現為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難,7月份出現20只3～6月齡山羊發病,主要表現為被毛粗亂,采食量減少、消瘦、流鼻涕、咳嗽,發病后期,羊鼻甲骨軟化,用手按即可凹陷。到10月23日,已有32只山羊發病,主要以羔羊為主,2～6月齡羊發病28只,成年羊發病4只。這次疫情共發病32只,發病率為25.19%,17頭出現死亡,死亡率為53.13%。該羊場發病早期已用青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、板藍根、魚腥草等抗生素和中草藥進行治療,無明顯好轉。據了解該場使用過三聯四防、口蹄疫疫苗、小反芻獸疫疫苗、傳染性胸膜肺炎疫苗等進行免疫。

2 剖檢病變

筆者對送檢的3只病羊進行剖檢,發現病羊的肺臟與肋骨粘連,肺部兩側邊緣呈“肉變”,肺小葉間質增寬,其中1只腹腔內有少量積液;鋸開頭部,3只病羊左、右兩側鼻道內均可有灰白色息肉狀物,表面光滑,呈透明狀;其他臟器未見明顯病變(見中插彩版圖1、圖2)。

3 實驗室檢驗

3.1 細菌和支原體分離鑒定 取病死羊的鼻內容物、肺臟組織和腹腔滲出物,在血瓊脂平板上劃線進行病原菌的分離培養和純化,于37℃的恒溫培養24 h。同時對采集的鼻內容物和肺臟進行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS緩沖液制成10%勻漿,經離心后上清液進行支原體分離培養。并對病原菌的16S rRNA進行PCR擴增和測序。結果在平板上生長出針尖樣大小、光滑的菌落。對分離菌16S rRNA序列PCR擴增結果顯示,擴增出了目的片段,將分離菌的16S rRNA的序列在GenBank上進行比對,菌株與溶血性曼氏桿菌的同源性為100%,故分離菌為溶血性曼氏桿菌;支原體分離培養后經本研究室建立的三重PCR檢測方法進行擴增,結果顯示Mo陽性,Mmc和Mccp陰性,表明分離支原體為Mo。

3.2 病毒PCR檢測 對采集的鼻內容物和肺臟進行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS緩沖液制成10%勻漿,利用生工組織和病毒RNA提取試劑盒提取研磨樣品中的RNA,應用參考文獻[1]建立羊口瘡病毒和 ENTV PCR方法進行檢測。PCR結果顯示：ENTV的檢測結果為陽性,羊口瘡病毒檢測結果為陰性。

4 診斷結果

根據臨床癥狀、剖檢病變、流行病學及實驗室檢驗結果等綜合判斷,確診該山羊養殖場山羊本次發病是由于ENTV、Mo和Mh混合感染所致。

5 討論

山羊地方性鼻內腫瘤是由ENTV-2引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染病,該病主要臨床特征表現為食欲減退,呼吸困難,鼻漏,出現單側或兩側性增生物;該病呈世界性分布,其發病率為0.5%～15%[3],致死率為100%。該羊場的發病率高達25.19%,且多以羔羊為主,比文獻報道的發病率還要高。Mo是羊支原體性肺炎的主要病原之一,其臨床癥狀表現為高熱、咳嗽、喘氣、漸進性消瘦、肺和胸膜發生漿液性和纖維素性炎癥,病死率一般為30% ～50%,有的高達80% ～100%[4-5]。有文獻報道綿羊肺炎支原體感染山羊后,會導致支氣管上皮細胞嚴重損傷,使得溶血性曼氏桿菌、巴氏桿菌等細菌和病毒更容易侵入機體,造成混合感染。近年來Bessent、Rohana、李君璞均有報道綿羊肺炎支原體和溶血性曼氏桿菌混合感染的病例[6-8],未見 ENTV、Mo和 Mh同時感染山羊的報道。

在本次病例中,我們通過對病料進行細菌分離、PCR擴增和測序分析,成功分離到了1株Mh;通過支原體分離培養和PCR檢測,分離到了1株Mo;通過參考文獻合成引物對羊口瘡病毒和ENTV進行PCR擴增,檢測到了ENTV陽性;同時結合該病例臨床上主要癥狀、剖檢病變和流行病學等特點,確認該病例是由ENTV、Mo和Mh三種病原體混合感染所致。本病例表明引起山羊呼吸道疾病的病原體已經不單是支原體或者細菌的單一感染或者混合感染,已出現病毒、支原體和細菌三者混合感染的現象,使羊的疫病更加復雜化。

綜上所述,ENTV、Mo和Mh可混合感染山羊引起嚴重的呼吸道疾病,對山羊養殖業形成嚴重威脅。因此,在山羊養殖過程中,除了注重防控口蹄疫、小反芻獸疫、山羊傳染性胸膜肺炎等重大疫病外,還需注重對Mo、Mh和ENT的防控,因為這3種病原之間是哪一個是主要病原目前尚未有這方面的研究,并且國內外目前尚無ENT的有效疫苗和治療藥物,最有效的措施是凈化,通過撲殺病羊及帶毒羊的方法來控制該病。因此除了加強羊群的防疫工作,還應避免天氣變化等因素造成的應激和免疫功能降低從而引起繼發感染。