代謝組學技術在乳腺癌標志物篩選中的應用進展

吳靜，楊睿，劉樹業△

代謝組學（metabonomics）是“后基因組學”時期的一門新興學科，同基因組學、轉錄組學、蛋白質組學共同構成了系統生物學的核心內容［1］。與基因組學、轉錄組學以及蛋白質組學相比，代謝組學更關注生物體的表型，因此也是腫瘤潛在生物標志物篩選中最有前景的發展方向［2］。代謝組學以體液（包括尿液［3］、血清［4］、血漿等）、細胞［5］、組織［6］等樣本中分子質量低于1 ku的小分子化合物為研究對象，運用液相色譜-質譜聯合技術（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）、氣相色譜-質譜聯合技術（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）、磁共振波譜技術（nuclear magnetic resonance，NMR）等［7］高分辨率、高敏感度、高通量的現代儀器分析手段，對生物體系在生理或病理狀態下所有內源性小分子代謝產物的動態變化進行分析，從而描繪出生物體代謝輪廓，揭示代謝通路的改變［8］，探索內源性小分子物質與疾病發生發展間的關系［9］。

代謝組學的研究過程包括生物樣本的采集及預處理，代謝物的分離、檢測、鑒定以及數據分析，生物標志物識別和途徑分析。相比較于基因、轉錄和蛋白質組學，代謝組學技術具有明顯的研究優勢：生物體內的小分子化合物的組成較基因組、蛋白質組相對簡單，數量大約數千種；很多內源性小分子化合物的生化代謝網絡已經弄清，而目前對基因、蛋白質功能的認識還很有限；代謝組學反映的是細胞活動的最終產物［10］，也是基因組、轉錄組和蛋白質組綜合作用下的終末效應，具有很強的綜合信息優勢。因此，代謝組學被廣泛應用于多個領域，包括疾病診斷［11］、新藥研究與開發、藥物作用機制研究［12］和食品科學［13］等。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的健康［14-15］。目前研究已證實，乳腺癌的發生和進展與代謝異常密切相關［16］，而乳腺癌的常規檢測與研究中又缺乏高敏感度和高特異度的腫瘤標志物［17-18］，因此作為一種新型的研究方法，代謝組學可以分析乳腺癌發生發展中產生的所有代謝物的種類或濃度的變化［19］，識別有價值的潛在標志物，從而為乳腺癌的預防、早期診斷和個體化治療開辟新途徑。近年來，國內外學者通過代謝組學技術對乳腺癌患者的血清、血漿、尿液、組織等樣本中的小分子代謝物進行了研究，并取得一定的成效［20-21］。本文針對代謝組學技術篩選出的乳腺癌小分子代謝標志物的研究現狀進行綜述。

1 乳腺癌血液樣本潛在代謝標志物的篩選

血液樣本是代謝組學研究中最易獲得且最常用的樣本。Cui等［22］利用基于質譜的代謝組學技術研究了20例乳腺浸潤性導管癌患者和20例健康人的血清代謝譜，發現15個差異表達代謝物，這些代謝物參與了包括神經鞘脂類代謝、磷脂代謝和脂肪酸β氧化等多個代謝途徑，其中溶血磷脂酰乙醇胺和神經酰胺兩類信號脂類分子可能在乳腺浸潤性導管癌的發生發展中發揮了重要作用。因此，研究者認為代謝組學分析可能成為尋找疾病生物標志物的有利工具。Fan等［23］通過液相色譜-質譜和氣相色譜-質譜的方法對96例乳腺癌患者和79例健康人的血漿進行分析后發現了64個差異表達代謝物，與人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）陰性乳腺癌患者相比，HER-2陽性患者有氧糖酵解增加、葡萄糖異生和脂肪酸生物合成增多以及三羧酸循環減少；與雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性患者相比，ER陽性患者丙氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸和嘌呤代謝增加，甘油脂類分解代謝減少；研究者鑒定了8個差異性代謝物，包括肉堿、溶血磷脂膽堿［lysoPC（20：4）］、脯氨酸、丙氨酸、溶血磷脂膽堿［lysoPC（16：1）］、鵝脫氧膽堿甘氨酸、纈氨酸和2-辛烯二酸，它們可以用于預測乳腺癌的分子亞型，其受試者工作特征（ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）高達0.925，因此這些代謝物具有潛在的乳腺癌診斷價值。Leonardo等［24］利用高分辨率磁共振光譜技術分析了80例ER陰性早期乳腺癌和95例轉移性乳腺癌患者的血清樣本代謝譜，結果發現葡萄糖、脂類含量在轉移性乳腺癌組升高，組氨酸含量在轉移性乳腺癌組降低，這些代謝產物可以很好地區分早期乳腺癌和轉移性乳腺癌患者且與乳腺癌復發相關；研究者進一步應用風險預測模型對乳腺癌的復發進行了預測，其敏感度、特異度和預測準確性分別為82%、72%、75%，由此認為將血清代謝組學預測模型應用于ER陰性早期乳腺癌的復發預測具有廣闊的前景。Miolo等［25］運用液相色譜串聯質譜結合（Liquid chromatographycoupledwithtandemmass spectrometry）對HER-2陽性乳腺癌患者應用曲妥單抗聯合紫杉醇治療后的有效組（15例）和療效不佳組（19例）血清進行研究后發現，2個代謝物亞精胺和色氨酸可很好地區分2組患者，敏感度和特異度分別高達90%和87%。因此這一結果對于預測乳腺癌患者治療的療效和進行個體化治療具有重要價值。

2 乳腺癌組織樣本潛在代謝標志物的篩選

在組織代謝物的研究方面，Budczies等［21］利用氣相色譜和飛行時間質譜技術對270例乳腺癌組織和97例正常乳腺組織樣本進行代謝組學分析后發現，在正常乳腺組織中谷氨酸與谷氨酰胺含量呈正相關，而兩者在乳腺癌組織中呈負相關，56%的ER陽性乳腺癌組織和88%的ER陰性乳腺癌組織中谷氨酸的表達水平顯著升高；研究者通過單因素和多因素分析發現谷氨酸/谷氨酰胺水平升高與總體生存期延長有關，基因表達分析顯示谷氨酸水平升高與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）途徑的激活呈負相關，因此認為谷氨酸可能成為診斷乳腺癌的潛在生物標志物，為乳腺癌患者應用谷氨酰胺酶抑制劑治療提供了有利依據。Haukaas等［10］運用高分辨率魔角自旋磁共振光譜（High-resolution magic-angle spinning magnetic resonance spectroscopy，HR MAS MRS）結合層次聚類分析對228例未治療過的乳腺癌患者組織樣本進行研究，發現了3個有明顯差異代謝譜的代謝簇——Mc1、Mc2、Mc3，其中Mc1中甘油磷酸膽堿（GPC）和磷酸膽堿（PCho）的含量最高，Mc2中葡萄糖含量最高，而Mc3中乳酸鹽和丙氨酸含量最高；研究者進一步通過代謝物綜合通路分析結合基因、蛋白質表達數據揭示了3個代謝簇在糖酵解/糖異生和甘油磷脂代謝方面具有顯著差異，乳腺癌相關蛋白亞型的表達分布也具有明顯差異，如膠原蛋白和細胞外基質相關的基因在Mc1中表達下調，而在Mc2和Mc3中表達上調。這一結果不僅為乳腺癌的異質性提供了新的信息，更重要的是為乳腺癌患者應用不同代謝靶向藥物進行治療提供了重要指導。

3 乳腺癌尿液樣本潛在代謝標志物的篩選

在尿液代謝物的研究方面，Yu等［26］應用毛細管電泳聯合質譜方法分析了21例晚期乳腺癌患者化療前后和21例健康人的尿液樣本后發現，與健康人相比，對化療敏感的患者30%的代謝物發生水平改變，而對化療不敏感的患者只有9%的代謝物發生水平改變；在化療敏感組患者中，甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、胱氨酸和色氨酸的水平在化療后顯著下降，而在對化療不敏感的患者中，大部分氨基酸均未表現出明顯的差異。因此，研究者認為尿液代謝產物有望作為評估乳腺癌患者化療療效的潛在預測指標。Fathi等［27］通過液相色譜串聯質譜方法對全世界首例報道的異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）p.R132L突變的轉移性激素受體陽性（hormone receptor-positive，HR+）乳腺癌患者和6例無IDH1突變的轉移性HR+乳腺癌患者的血清和尿液樣本進行分析后發現，具有IDH1 p.R132L突變患者的血清和尿液中2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）水平顯著升高，因此他們認為IDH1突變誘發的乳腺癌可能與癌代謝物2-HG的異常產生和蓄積有關。這一結果為通過無創檢測2-HG的水平來監測乳腺癌，以及開發和研究針對異常IDH1酶的靶向治療提供了重要指導。

目前，代謝組學研究已經成為腫瘤研究的一個新方向。代謝組學整體性、宏觀性、高通量、廉價快捷的特點使其在乳腺癌潛在標志物的篩選方面具有無可比擬的優勢，許多小分子已經在臨床診斷中應用。盡管如此，代謝組學要想在臨床腫瘤檢測中被廣泛推廣和應用，還需要進一步完善和發展，如建立樣本獲取、保存和制備的統一標準流程，不斷擴大和更新將不同腫瘤特征表型與相關代謝組學數據相聯的公用數據庫，進一步降低檢測成本。此外，還需要經過更大規模的前瞻性的臨床研究來驗證篩選出的代謝標志物在腫瘤的診斷、治療、療效評估方面的敏感度和特異度，才能最終將其作為腫瘤標志物應用于臨床。此外，隨著“精準醫療”概念在臨床診斷和治療中的推廣，未來將個體的代謝組學數據結合基因組學、蛋白質組學分析可以更好地指導臨床腫瘤的個體化治療。