喀斯特山區草地施肥對放牧烏蒙半細毛羊抗氧化系統功能的影響

廖建軍, 申小云，2，3, 霍賓,2, 熊康寧*

(1.貴州師范大學喀斯特研究院，國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽550001；2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽621010；3.中國西南世界銀行扶貧項目貴州辦公室，貴州 貴陽550004)

中國西南喀斯特地區石漠化面積分布廣泛，水土流失嚴重，土地貧瘠。烏蒙山區是西南方喀斯特地區的核心, 是我國裸露型喀斯特集中連片分布最廣的區域之一，植被覆蓋率低，成土物源匱乏，峰巒重疊，水土流失嚴重，土地資源和眾多人口的矛盾日益突出，生態足跡遠遠超過生態承載力[1]。烏蒙山區也是長江和珠江中上游最重要的生態屏障，是我國南方草地畜牧業的精華所在，擁有豐富的水熱資源，是植物營養體生長的良好環境。飼用植物非常豐富, 發展山地生態畜牧業具有得天獨厚的自然條件[1-2]。在烏蒙山區發展草地生態畜牧業對提高喀斯特區域農牧業生產效率, 增加貧困人口收入, 治理生態環境等方面都具有重要的戰略意義。

20世紀80 年代，在烏蒙山區的威寧縣進行飛播人工草場獲得成功，拉開了南方現代草地畜牧業建設的序幕。廣泛建植的黑麥草(Loliumperenne)/白三葉(Trifoliumrepens)草地成為了該區主要的放牧草地和割草地[3-4]。近年來，由于牲畜數量快速增長及草地資源的不合理利用，造成草地退化沙化，產草量下降，草地生態系統功能遭受嚴重破壞。因此，在烏蒙山區開展草地畜牧業放牧系統的研究，對生態環境的治理和促進農牧業經濟發展具有十分重要的意義。烏蒙半細毛羊分布于貴州、云南、四川三省交界的烏蒙山區。貴州的威寧、赫章、大方、水城等縣是核心產區，云南昭通和四川涼山也有部分分布，現存欄110萬只[4]。烏蒙半細毛羊是利用威寧本地綿羊(藏系山谷型粗毛羊即威寧綿羊)導入肉毛兼用的考力代血液雜交育成的毛肉兼用型羊種，經1974-1981年的級進雜交，1982-1984年的橫交固定，1984-1990年的擴群推廣，已經形成一個生產性能較好，遺傳性能相對穩定的綿羊育種群體[5]。成年公羊和母羊的體重分別為(50.62±5.38) kg和(40.31±5.93) kg。成年公羊和母羊剪毛量分別為5.56 kg和4.12 kg。成年羊毛長9.33～13.95 cm，羊毛細度50～58紗支(主體細度56紗支)，凈毛率56.72%。周歲羯羊屠宰率47.36%，成年羯羊屠宰率52.02%。產羔率106.59%[4,6]。烏蒙半細毛羊生產性能高，對高寒牧區適應性強，性情溫馴，便于管理，是經過多年培育的優良品種，在高寒牧區草地畜牧業的發展中起到了關鍵作用。

動物機體抗氧化系統是機體抵抗自由基損害的防御系統，包括酶系統和非酶系統，酶系統由超氧化物歧化酶、谷胱苷肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶組成；非酶系統由維生素C、維生素E、谷胱苷肽、半胱氨酸、銅、鐵、鋅、硒等物質組成[7-9]。機體抗氧化系統的功能是清除機體過多的自由基。自由基產生過多，或抗氧化系統的功能下降將導致生物體內自由基大量過剩，引起對動物機體的損害。主要表現是細胞膜變性，蛋白質損傷，DNA鏈斷裂，DNA發生突變等，最終導致生物體出現各種疾病，乃至衰老和死亡[8-9]。機體抗氧化系統的功能同多種礦物質元素有著重要的關系，礦物質元素含量太低或過高都會引起機體抗氧化系統功能下降，同時元素之間又相互聯系相互影響[6,10]。施肥處理，常常打破土壤原有的元素平衡，引起土壤性質變化，導致植物元素含量的變化，影響植物的生長發育，從而通過食物鏈影響動物機體抗氧化系統的功能，最終使整個生態系統受到不良影響。

為了探討施肥對放牧草地烏蒙半細毛羊抗氧化系統功能的影響，尋找最適合該區草地的肥料，在威寧縣涼水溝多年生人工草地開展不同氮素肥料的施肥試驗和放牧試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗區的自然概況

試驗牧場位于貴州省威寧縣涼水溝種羊場，屬于多年生人工草地，東經103°36′-104°45′，北緯26°36′-27°26′。氣候特點是冬天寒冷，夏天涼爽，年平均氣溫10～12 ℃，年平均降水量962 mm，海拔2000 m以上。主要植物種類有：黑麥草、白三葉、細葉苔草(Carexrigescens)、羊茅(Festucaovina)、早熟禾(Poaannua)、翻白委陵菜(Potentilladiscolor)、西南委陵菜(Potentillafulgens)。該區水熱資源豐富，極適宜營養體農作物和牧草的生長，發展草地畜牧業具有得天獨厚的自然條件[6]。

1.2 試驗設計

牧場施肥處理：預備試驗的研究發現每公頃草地施90 kg的氮(N)，牧草生長良好。因此，選擇每公頃草地施90 kg的氮為試驗氮肥的用量。試驗共分為3個處理。其中，處理1：用硫酸銨[(NH4)2SO4]施肥；處理2：用硝酸銨(NH4NO3)施肥；處理3：對照組，不施肥。試驗從2016年6月1日開始，2016年9月1日結束，共進行92 d。放牧動物：選擇1歲烏蒙半細毛羊公羊30只(體重、發育和營養狀況接近，經臨床檢查健康)，隨機分為3組，隨機分配到試驗1的牧場，每組10只。

1.3 樣本采集

試驗開始前，在施肥牧場和對照牧場采集土壤樣本，處理1、處理2和處理3各采集樣本10個，深度為1～20 cm，去除石塊和殘根等雜物，裝袋。試驗開始和結束時，分別在處理1、處理2和處理3各采集混合草樣10個。試驗開始和完成時，采集30只試驗動物頸靜脈血，每個動物15 mL。

1.4 樣品的處理

土樣放室內20～25 ℃陰涼通風處風干，粉碎后用2 mm篩子過一遍，再用0.075 mm篩子除去細沙，試驗前，消化管壁用少量去離子水沖洗，取土樣0.3 g左右放入消化管內，加6 mL硝酸銨和1 mL雙氧水，搖勻，靜置10 min。按微波消化程序消解，冷卻，將溶液移入100 mL容量瓶中。

草樣20～25 ℃自然風干，粉碎，然后過0.175 mm細篩，裝袋備用。試驗時消化管壁用少量去離子水沖洗，取草樣0.5 g左右放入消化管內，加6 mL硝酸(HNO3)和1 mL雙氧水(H2O2)，搖勻，靜置10 min。按微波消化程序消解，冷卻，將溶液移入100 mL容量瓶中，稀釋至刻度。

血液樣本用肝素鈉抗凝，血液變涼后，4 h內低溫(4～8 ℃)運回實驗室用于礦物質元素、血常規、生理生化指標和抗氧化指標的分析。

1.5 礦質元素的測定

土壤、牧草和血液中礦物質元素含量應用電感耦合等離子體原子發射光譜法測定(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy，ICP-AES)[6]，使用儀器為電感耦合等離子體發射光譜儀(HK9600 Type Atomic Emission Spectroscopy，Huaketiancheng Co.,Ltd，China)。測定時按電感耦合等離子體發射光譜儀操作程序開機，進入Winlab32系統操作軟件，等離子體(Plasma)點火后，對空白溶液、標準溶液、樣品溶液依次進行測試。

1.6 生理生化和抗氧化指標的檢測

用全自動血細胞分析儀(SF-3000, SysmexToa Medical Electronics, Kobe, Japan)檢測全血中白細胞數(WBC)、紅細胞數(RBC)、血紅蛋白(HB)、紅細胞壓積容量(PCV)。用全自動生化分析儀(Automatic Biochemical Analyzer, MindrayBS-420, China)檢測血漿中谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、血尿素氮 (BUN)、總膽固醇(Chol)、銅藍蛋白(Cp)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的活力和含量。

1.7 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 施肥對牧草礦物質元素含量的影響

施肥牧場牧草氮的含量極顯著高于對照組(P<0.01)，但施肥處理之間沒有顯著差異(表1)。硫酸銨施肥引起牧草鋅和硫的含量極顯著高于硝酸銨施肥與對照組(P<0.01)，但硝酸銨施肥與對照組之間無顯著差異。硫酸銨施肥引起牧草硒含量極顯著低于硝酸銨施肥牧場與對照牧場(P<0.01)，但硝酸銨施肥牧場同對照牧場之間牧草硒含量無顯著差異。硫酸銨和硝酸銨施肥對牧草其他元素含量無明顯影響。

表1 施肥對牧草礦物質含量的影響Table 1 Effect of fertilization on mineral element contents in forage (μg·g-1)

注：同行不同字母者，表示不同處理間差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: Different letters within a line indicate significant difference atP<0.01 level. The same below.

2.2 施肥處理對血液礦物質含量的影響

試驗開始時，烏蒙半細毛羊血液礦物質元素含量在各處理沒有顯著差異(表2)。試驗結束時，硫酸銨施肥牧場烏蒙半細毛羊血液鋅和硫的含量極顯著高于硝酸銨施肥牧場和對照牧場(P<0.01)，但烏蒙半細毛羊血液鋅和硫的含量在硝酸銨施肥牧場和對照牧場之間沒有顯著差異。硫酸銨施肥引起烏蒙半細毛羊血液銅、鐵和硒含量極顯著低于硝酸銨施肥牧場與對照牧場(P<0.01)，但硝酸銨施肥牧場同對照牧場之間烏蒙半細毛羊血液銅、鐵和硒含量無顯著差異。硫酸銨和硝酸銨施肥對烏蒙半細毛羊血液其他含量無顯著影響。

2.3 施肥對血液指標的影響

試驗開始時，烏蒙半細毛羊血液指標在各處理間沒有顯著差異(表3)。試驗結束時，硫酸銨施肥牧場烏蒙半細毛羊血紅蛋白(Hb)含量和紅細胞壓積容量(PCV)極顯著低于硝酸銨施肥的牧場和對照組(P<0.01)，但二者在硝酸銨施肥牧場同對照牧場之間無顯著差異。硫酸銨和硝酸銨施肥對烏蒙半細毛羊血液紅細胞計數(RBC)和白細胞計數(WBC)無極顯著影響。

表2 施肥對烏蒙半細毛羊血液礦物質含量的影響Table 2 Effect of fertilization on mineral element contents in blood of the Wumeng semi-fine sheep (μg·g-1)

表3 施肥處理對烏蒙半細毛羊血液指標的影響Table 3 Effect of fertilization on blood indexes in the Wumeng semi-fine sheep

2.4 施肥對烏蒙半細毛羊血清生化值的影響

硫酸銨和硝酸銨施肥對烏蒙半細毛羊乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、血尿素氮(BUN)和總膽固醇(Chol)無顯著影響(表4)。

表4 施肥對烏蒙半細毛羊血液生化值的影響Table 4 Effect of fertilization on biochemical values in the Wumeng semi-fine wool sheep

2.5 施肥對烏蒙半細毛羊抗氧化指標的影響

試驗開始時，血清抗氧化酶無顯著差異(表5)。試驗結束時，硫酸銨施肥牧場烏蒙半細毛羊血清銅藍蛋白含量、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過氧化物酶活力和血液過氧化氫酶活力極顯著低于硝酸銨施肥的牧場和對照組(P<0.01)；但他們在硝酸銨施肥牧場和對照組之間均沒有顯著差異。

表5 施肥對烏蒙半細毛羊抗氧化指標的影響Table 5 Effect of fertilization on antioxidant indexes in the Wumeng semi-fine wool sheep

3 討論

硫是植物重要的營養。Shen[7]報道，硫酸銨施肥顯著增加牧草硫含量，而沒有增加牧草產量，在黃河首曲高寒草甸進行連續3年的研究，用86 kg·hm-2的硫酸銨施肥，牧草的硫含量達0.23%，用174 kg·hm-2的硫酸銨施肥，牧草硫含量高達3.0%，而沒有施硫肥的牧場，牧草硫的含量只有0.1%。在目前的研究中，用含90 kg氮的硫酸銨施肥明顯增加牧草硫含量。同時，研究表明，硫干擾銅的吸收引起烏蒙半細毛羊銅缺乏[11-15]。銅是超氧化物歧化酶表現催化活性的必需元素，任何其他元素代替銅離子，超氧化物歧化酶都不能維持活性，因此，動物銅缺乏將嚴重影響超氧化物歧化酶的活性，降低機體抗氧化系統功能[16]。

銅缺乏對過氧化氫酶的影響是通過影響血液鐵含量而起作用的。動物缺銅，肝銅貯備下降最終導致血液銅濃度降低，引起銅藍蛋白濃度降低，而銅藍蛋白能把Fe3+通過細胞膜攜出細胞，銅藍蛋白濃度降低引起組織中貯存的鐵不能被動員，吞噬細胞中鐵滯留，貯存在細胞內的鐵無法進入血液，從而使鐵積聚于細胞膜的內側，引起血液鐵含量降低[16-18]。過氧化氫酶是血紅素酶，不同來源的過氧化氫酶結構雖有不同，但多數是由4個相同的亞基組成，每一個亞基有一個以上高度自旋Fe3+為中心的活性部分[19]。當鐵含量降低必然引起過氧化氫酶活性的下降，危害機體抗氧化系統功能。過氧化氫酶是生物在進化過程中建立起來的生物防御系統的關鍵酶之一，幾乎所有能呼吸的生物體內普遍存在，在清除過氧化氫，保護細胞的膜系統中起著重要的作用。

硫酸銨在土壤水溶液中電離成銨離子和硫酸根離子，植物吸收銨離子的數量多于硫酸根的數量，導致草地土壤殘留較多的硫酸根離子，這些硫酸根離子和氫離子相結合，土壤變酸，酸性土壤促進植物對鋅的吸收[20-22]。因此，本研究中，硫酸銨施肥牧場的牧草鋅含量顯著高于硝酸銨施肥和對照牧場。硫是影響植物吸收硒的重要因素之一，在土壤中硒酸鹽的溶解度大于亞硒酸鹽，其常與硫酸鹽并存，易為植物吸收。硫酸鹽與硒酸鹽之間存在拮抗作用，硒酸鹽與硫酸鹽于植物根部競爭相同的吸收位點，即以相同的親和力在植物根部細胞壁上結合相同的載體，以兩種物質的濃度比決定它們被吸收的程度[21-23]。因此，硫酸銨施肥牧場牧草硒含量降低的主要原因是由硫和硒之間的相互作用引起的。硒是動物體中必需礦物質元素之一，同時也是谷胱苷肽過氧化物酶的活性中心元素，谷胱苷肽過氧化物酶可清除動物機體內過氧化物和過氧化氫。硒主要通過谷胱苷肽過氧化物酶發揮抗氧化作用，硒缺乏引起谷胱苷肽過氧化物酶活性降低，嚴重影響機體抗氧化系統功能[24-28]。

綜上所述，在低銅牧場應用硫酸銨施肥，增加牧草硫含量，降低了牧草硒含量，由于銅和硫在生態系統中的相互作用，通過食物鏈引起動物硒和銅缺乏，造成機體抗氧化系統功能受損。因此，在銅和硒含量相對較低的牧場，最好不要選擇含硫的肥料施肥。低銅牧場應用含硫肥料，將因為植物硫含量增加引起放牧動物反芻動物次級銅缺乏。硒含量低的牧場應用含硫肥，將降低牧草硒含量，引起動物硒缺乏，影響機體抗氧化系統功能，影響生長發育，引起動物機體各種疾病，通過物質循環和能量流動，最終使整個生態系統受到不良影響。

References：

[1] Zhou S S, Sun H, Liao J F,etal. Effects of grazing on the vegetation composition ofLoliumperenneandTrifoliumrepensmixed pasture. Pratacultural Science, 2012, 29(5): 814-820.

周姍姍, 孫紅, 廖加法, 等. 放牧對黑麥草+白三葉混播草地植被構成的作用. 草業科學, 2012, 29(5): 814-820.

[2] Luo J C, Zhou M, Wang Z L,etal. Fluxion and regulation of selenium in soil, plants, and animals in grassland grazing system. Pratacultural Science, 2017, 34(4): 869-880.

羅建川, 周梅, 王宗禮, 等. 硒在草地放牧系統“土壤-植物-動物”間的流動與調控. 草業科學, 2017, 34(4): 869-880.

[3] Li K, Zhu J Z. Effect of boron and molybdenum on the seed yield alfalfa. Pratacultural Science, 2009, 26(1): 61-63.

李科, 朱進忠. 硼、鉬元素對苜蓿種子的增產效果. 草業科學, 2009, 26(1): 61-63.

[4] Shen X Y, Chi Y K, Xiong K N,etal. Serum biochemical values and mineral contents of tissues in Guizhou semi-fine wool sheep. Journal of Animals and Veterinary Advance, 2013, 12(11): 1078-1080.

[5] Li L J, Shen X Y. Development progress and breeding status of Guizhou semi-fine wool sheep. Guizhou Agricultural Sciences, 2010, 38(11): 182-184.

李麗娟, 申小云. 貴州半細毛羊的培育歷程與養殖現狀. 貴州農業科學, 2010, 38(11): 182-184.

[6] Shen X Y, Jiang H M, Yuan R,etal. Effect of nitrogen fertilizer source on mineral element content of forage and in the blood of grazing Guizhou semi-fine sheep. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(3): 275-280.

申小云, 蔣會梅, 苑榮, 等. 草地施肥對牧草和放牧貴州半細毛羊的影響. 草業學報, 2012, 21(3): 275-280.

[7] Shen X Y. Effect of nitrogenous fertilizer treatment on mineral metabolism in grazing yaks. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(3): 361-368.

[8] Shen X Y, Du G Z, Li H. Studies of a naturally occurring molybdenum-induced copper deficiency in the yak. The Veterinary Journal, 2006, 171(2): 352-357.

[9] Tiffany M E, Mc Dowell L R, O’connor G A,etal. Effects of residual and reapplied biosolids on performance and mineral status of grazing beef steers. Journal of Animal Science, 2002, 80: 260-266.

[10] Wang K, Tang R H, Xu H B,etal. Trace Element in Life Science. Beijing: China Metrology Press, 1999: 321-675.

王夔, 唐任環, 徐輝碧, 等. 生命科學中的微量元素. 北京: 中國計量出版社, 1999: 321-675.

[11] Wang Z Y, Cao G X, Hu Z Z,etal. Mineral Element Metabolism and Animal Disease. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 1995: 231-356.

王宗元, 曹光辛, 胡在朝, 等. 動物礦物質營養代謝與疾病. 上海: 上海科學技術出版社, 1995: 231-356.

[12] Arthington J D, Rechcigl J E, Yost G P,etal. Effect of ammonium sulfate fertilization on bahiagrass quality and copper metabolism in grazing beef cattle. Journal of Animal Science, 2002, 80: 2507-2512.

[13] Hardt P F, Greene L W. Forage mineral concentration, animal performance, and mineral status of heifers grazing cereal pastures fertilized with sulfur. Journal of Animal Science, 1991, 69: 2310-2320.

[14] Shen X Y, Du G Z, Chen Y M,etal. Copper deficiency in Guizhou semi-fine sheep on pasture in western China. The Canadian Veterinary Journal, 2006, 47: 902-906.

[15] Chan Y H, Siu C W, Yiu K H,etal. Adverse systemic arterial function in patients with selenium deficiency. Journal of Nutrition Health and Aging, 2012, 16(1): 85-88.

[16] Hurst R, Siyame E W, Young S D,etal. Soil-type influences human selenium status and underlies widespread selenium deficiency risks in Malawi. Scientific Reports, 2013, 3(2): 1425.

[17] Liu C P, Fu J, Lin S L,etal. Effects of dietary selenium deficiency on mRNA levels of twenty-one selenoprotein genes in the liver of layer chicken. Biological Trace Element Research, 2014, 159(3): 192-198.

[18] Nangliya V I, Sharma A, Yadav D,etal. Study of trace elements in liver cirrhosis patients and their role in prognosis of disease. Biological Trace Element Research, 2015, 160(1): 135-141.

[19] Xu S W, Yao H D, Zhang J,etal. The oxidative damage and misbalance of calcium homeostasis in brain of chicken induced by selenium deficiency. Biological Trace Element Research, 2013, 151(2): 225-233.

[20] Shen X Y. Forage strategy of Przewalski’s gazelle under selenium stress. Acta Ecologica Sinica, 2009, 29(6): 2775-2781.

申小云. 硒脅迫下普氏原羚的采食對策. 生態學報, 2009, 29(6): 2775-2781.

[21] Coleman R. The importance of sulfur as a plant nutrient in world crop production. Soil Science, 1966, 101: 230-239.

[22] Martin W E, Walker T W. Sulfur requirement and fertilization of pasture and forage crops. Soil Science, 1966, 101: 248-257.

[23] Rechcigl J E. Sulphur fertilization improves bahiagrass pasture. Better Crops Plant Food, 1991, 75: 22-24.

[24] Shen X Y, Li X, Zhang R D. Studies of “Unsteady Gait Disease” of the Tibetan Gazelle (Procapra picticaudata). Journal of Wildlife Diseases, 2010, 46(2): 560-563.

[25] Kelly C W, Brian C T, Itai S,etal. Fermentation, hydrogen, and sulfur metabolism in multiple uncultivated bacterial phyla. Science, 2012, 337(6102): 1661-1665.

[26] Jeffrey M, Duff J P, Higgins R J,etal. Polioencephalomalacia associated with the ingestion of ammonium sulphate by sheep and cattle. Veterinary Record, 1994, 134: 343-348.

[27] Smart M E, Cohen R, Christensen D A,etal. The effect of sulphate removal from the drinking water on the plasma and liver copper and zinc concentrations of beef cows and their calves. Canadian Journal of Animal Science, 1986, 66: 669-680.

[28] Suttle N F. Mineral Nutrition of Livestock. 4th Edition. London: CABI Publishing, 2010: 597.