苜蓿黃酮對脂多糖誘導下奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響

占今舜，陳小連，詹康，蘇效雙，趙國琦*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200)

乳腺上皮細胞是合成和分泌乳汁主要場所，當奶牛該組織在金黃葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等病原菌感染下，會產生乳房炎，進而導致產奶量和乳品質下降。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內毒素，是革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等細胞壁中的一種成分，當細菌死亡溶解時，其釋放出來會使乳腺組織等產生損傷[1]。Shi等[2]研究發現，奶牛乳腺上皮細胞的活性隨著LPS濃度和培養時間的延長而降低；細胞的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性隨著LPS濃度的升高呈降低趨勢，而丙二醛(MDA)含量則呈升高趨勢。Sun等[3]發現，奶牛乳腺上皮細胞在10 μg·mL-1LPS刺激下，其細胞膜的滲透性增加，促進細胞凋亡。朱麗萍等[4]發現，奶牛乳腺上皮細胞在1 μg·mL-1LPS處理3～24 h后可顯著增加炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的表達。以上結果說明，LPS的刺激可促使乳腺上皮細胞的抗氧化能力下降，增加細胞膜的通透性，進而導致細胞凋亡。

黃酮類物質是含有2-苯基色原酮結構，以C6-C3-C6為碳架的一類化合物，是植物一種重要的次生代謝產物，廣泛存在于植物的根、莖、葉和花、果實中[5]。張城等[6]研究發現，軟骨細胞經LPS處理后，細胞增殖活性降低，細胞IL-1β、iNOS、P53基因mRNA的表達升高，而添加1 μg·mL-1金雀異黃酮能夠提高增殖活性和降低這些基因的表達。姜念等[7]發現，4′,5,7-三羥基異黃酮能夠拮抗人主動脈內皮細胞經LPS處理后引起的活力降低及ephrinB2和IL-6 mRNA的表達增加。另外，黃芪(Astragalusmembranaceus)總黃酮能夠抗小鼠RAW264.7細胞經LPS誘導的炎癥反應[8]。結果表明，黃酮類物質能夠提高細胞活性，發揮抗炎癥的作用。紫花苜蓿(Medicagosativa)被稱為“牧草之王”，是一種豆科多年生草本植物。苜蓿中黃酮含量較高，據報道，45個紫花苜蓿品種中有70%以上品種的總黃酮含量為0.6%～0.9%[9]。之前研究發現，在正常培養和熱應激情況下，添加75 μg·mL-1的苜蓿黃酮能夠提高體外培養奶牛乳腺上皮細胞的活性，改善抗氧化能力和抑制細胞凋亡[10-11]。黃酮類化合物具有抗炎癥作用，但不同種類可能作用存在差異。因此，本試驗研究在LPS刺激下，苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響，為苜蓿黃酮的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

脂多糖(LPS，血清型O55:B5)購于美國Sigma公司，試驗所用苜蓿黃酮和奶牛乳腺上皮細胞與文獻[11]相同。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞活性檢測 試驗于2016年7月開始進行，細胞活性采用CCK-8法進行檢測。試驗方法如下：試驗分為4組，即基礎培養基(Con)、基礎培養基中加入1 μg·mL-1的LPS(L)、基礎培養基中加入1 μg·mL-1的LPS和75 μg·mL-1苜蓿黃酮(L+F)、基礎培養基中加入75 μg·mL-1苜蓿黃酮(F)，每組5個重復，其中苜蓿黃酮用二甲基亞砜[DMSO(索萊寶，北京)]完全溶解，4個處理組中的DMSO含量低于2‰。在96孔板中，接種100 μL·孔-1的細胞懸液，懸液中含有1×104個的乳腺上皮細胞，然后在37 ℃，5% CO2培養箱中進行培養。待細胞完全貼壁后，去除培養基，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗兩次后加入不同處理的培養基100 μL·孔-1。細胞培養12和24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(購于上海碧云天公司)，在培養箱中孵育3 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光值，然后計算細胞活性。

細胞相對活性=(As-A0)/(Ac-A0)×100%

式中:As為試驗組的OD值；Ac為對照組的OD值；A0為空白組(只有培養基)的OD值。

1.2.2活性氧(ROS)的檢測 細胞內的ROS采用DCFH-DA檢測探針(購于南京建成生物工程研究所)來檢測。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。取密度為1×105個·mL-1細胞接種到12孔板中，在37 ℃，5% CO2培養箱中進行培養24 h，去除培養基，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細胞培養12 h后，去除細胞培養基，PBS清洗，然后加入含有DCFH-DA(稀釋1000倍)培養基1 mL孵育1 h。細胞孵育之后，加入胰酶消化細胞(消化時間4 min)，加入培養基終止消化，制成懸液。將細胞懸液進行1500 r·min-1離心5 min收集細胞，然后用PBS清洗一次，加入200～300 μL PBS重懸細胞，然后用流式細胞儀進行檢測，檢測由揚州大學檢測中心完成。

1.2.3炎癥因子基因的檢測 取密度為5×105個·mL-1細胞接種到6孔板，在37 ℃，5% CO2培養箱中進行培養24 h，去除培養基，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細胞培養12 h后，去除細胞培養基，然后提取RNA。細胞RNA提取、cDNA合成和RT-PCR等的方法和條件同文獻[12]。引物由Invitrogen公司合成，炎癥因子相關基因引物序列見表1。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.2.4凋亡相關蛋白的檢測 取密度為5×105個·mL-1細胞接種到6孔板，在37 ℃，5% CO2培養箱中進行培養，當每孔細胞鋪滿時，將培養基去除，PBS清洗兩次，試驗分組同上。細胞培養12 h后，去除細胞培養基，提取細胞蛋白，然后進行Western bolt檢測。一抗：p53購于英國Abcam公司，GAPDH、p38、P-p38和Caspase3購于美國Cell Signaling Technology公司；二抗(羊抗鼠、羊抗兔)購于美國Cell Signaling Technology公司。檢測方法如下：

1)根據蛋白分子量的大小配制相應的SDS分離膠(10%～12%)，將分離膠打入制膠板中，加入無水乙醇，室溫放置40 min凝膠后，去除乙醇，加入濃縮膠，插入梳子后室溫放置40 min。

2)將制好的膠轉入電泳槽中進行電泳，蛋白樣品上樣量為30 μg，電泳條件為140 V，15 min；110 V，65 min。

3)根據蛋白分子量的大小和參照Marker進行切膠，鋪膜，然后在電壓100 V下轉膜80 min。

4)轉膜結束后，根據蛋白分子量的大小和參照Marker進行剪膜，然后進行封閉2 h，封閉結束后用雜交膜清洗液清洗3次。

5)加入一抗在冰上進行孵育12～16 h，結束后用雜交膜清洗液清洗3次。

6)加入二抗在搖床上孵育2 h，用雜交膜清洗液清洗3次后再用雙色紅外激光成像系統對膜進行掃描、成像，最后利用Image J軟件進行灰度值分析，然后根據目的蛋白與GAPDH比值進行結果計算。

1.3 數據處理

基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算[13]，用Excel 2007進行試驗數據處理，采用IBM SPSS Statistics 21.0單因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細胞活性的影響

從圖1中可知，細胞培養12 h時，L組的細胞相對活性極顯著低于其他各組(P<0.01)；培養24 h時，F組的細胞相對活性極顯著低于對照組(P<0.01)，而顯著高于其他兩組(P<0.05)。結果表明，苜蓿黃酮能夠抑制LPS刺激12 h細胞活性的下降。

2.2 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細胞ROS的影響

從圖2中可知，與對照組相比，其他各組的ROS濃度極顯著升高(P<0.01)；而與L組相比，L+F組和F組的ROS濃度顯著降低(P<0.05)。結果表明，苜蓿黃酮能夠降低LPS刺激下細胞內ROS濃度。

圖1 苜蓿黃酮對LPS刺激12和24 h下奶牛乳腺上皮細胞活性的影響Fig.1 Effect of alfalfa flavonoids on cell viability of BMECs induced by LPS for 12 and 24 h

圖2 苜蓿黃酮對LPS刺激下細胞內ROS水平的影響Fig.2 Effect of alfalfa flavonoids on the level of ROS in BMECs induced by LPS

Con為對照組、L為脂多糖組、L+F為脂多糖加苜蓿黃酮組、F為苜蓿黃酮組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。Con is the control group, L is the LPS group, L+F is the LPS and alfalfa flavonoids group, F is the alfalfa flavonoids group. Values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.3 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細胞炎癥因子基因表達的影響

從表2中可知，與對照組相比，L組IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88的表達均極顯著升高(P<0.01)，而F組無顯著性差異；與L組相比，L+F組IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)和TLR2(P<0.01)的表達顯著降低。結果表明，苜蓿黃酮能夠下調LPS刺激下細胞炎癥因子的表達，提高細胞的抗炎癥作用。

表2 苜蓿黃酮對LPS刺激下細胞炎癥因子基因表達的影響Table 2 Effect of alfalfa flavonoids on gene expression of inflammatory factors in cells stimulated by LPS

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: In the same row, values with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05),values with different capital letters mean highly significant difference (P<0.01) and the same letter mean no significant difference (P>0.05).The same below.

2.4 苜蓿黃酮對脂多糖刺激下細胞凋亡蛋白表達的影響

圖3 Western blot 結果Fig.3 The results of Western blot

利用軟件對圖3的條帶進行計算，結果見表3。與對照組相比，在LPS刺激下，p53(P<0.01)、Caspase3(P<0.01)、p38(P<0.05)和P-p38(P<0.01)蛋白的表達顯著升高，而添加苜蓿黃酮能夠顯著降低p53和p38蛋白的表達(P<0.05)。與對照組相比，在沒有LPS刺激下，添加苜蓿黃酮顯著升高了Caspase3蛋白的表達。結果表明，LPS能夠促進細胞凋亡蛋白的表達，而苜蓿黃酮能夠下調LPS刺激下細胞凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡。

表3 苜蓿黃酮對LPS刺激下細胞凋亡蛋白表達的影響Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on expression of apoptosis protein in cells stimulated by LPS

3 討論

脂多糖能夠降低細胞的存活率，抑制細胞增殖。劉立新等[14]研究發現，LPS能夠抑制奶牛乳腺上皮細胞的增殖。王亨等[15]發現，添加100 mg·L-1的LPS能夠顯著抑制奶牛乳腺上皮細胞的增殖。本試驗得到相似結果。之前的研究發現[10-11]，在正常培養和熱應激下，添加苜蓿黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞活性。之前有報道稱，奶牛乳腺上皮細胞活性隨LPS濃度的升高呈下降趨勢，且隨著培養時間的延長，活性也呈下降趨勢[2]。研究發現，低濃度雌激素能夠促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖，并可以提高SOD活性來發揮抗氧化作用，而高濃度則抑制細胞增殖和降低抗氧化能力，引起細胞損傷[16]。而紫花苜蓿黃酮以木犀草素、槲皮素、染料木黃酮等黃酮類物質為主，而這些物質均能發揮植物雌激素的作用[17]，在本試驗中，苜蓿黃酮能夠提高LPS刺激12 h奶牛乳腺上皮細胞的活性，而對刺激24 h的效果不明顯。可能是因為LPS作用時間太長對細胞損傷較大，而且苜蓿黃酮隨著培養時間的延長可能發揮類雌激素作用，進而抑制細胞的增殖。說明苜蓿黃酮能夠減緩LPS對細胞的損傷，而且可能存在時間依賴性。LPS能夠導致奶牛乳腺上皮細胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低，而升高MDA含量[2]。而之前試驗發現[10-11]，苜蓿黃酮能夠提高細胞抗氧化酶類的活性，因此，苜蓿黃酮提高細胞活性可能與其提高細胞抗氧化能力有關。

LPS是一種重要的炎癥反應因子，能夠誘導TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細胞因子參與炎癥反應。Chanput等[18]研究發現，槲皮素、楊梅酮、圣草酚、柚皮素、蘆丁和芹黃素均能夠降低單核細胞炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-8和IL-10基因的表達。另外，黃芪總黃酮、染料木黃酮和芫花總黃酮均能夠抑制RAW264.7細胞TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的分泌，從而發揮抗炎[8,19-20]。本試驗結果與其相似，表明苜蓿黃酮亦發揮了抗炎癥的作用。Toll樣受體家族(TLRs)能夠與不同病原體相關分子模式結合，導致下游目的基因的活化，進而誘導免疫應答的發生。在此過程中存在兩種信號轉導通路，即依賴MyD88和非依賴MyD88。除TLR3為非依賴MyD88，其他均為依賴MyD88[21]。Li等[22]研究發現，芒果苷能夠抑制LPS誘導口腔上皮細胞TLR2和TLR4的過表達，抑制NF-κB、p38和JNK的表達。Feng等[23]發現，大豆黃酮能夠抑制LPS誘導小鼠肺組織的TLR4、MyD88的過表達和NF-κB活性。Sun等[24]研究發現，黃芩苷可能通過抑制TLR2和TLR4/MyD88/p38/NF-κB信號來達到抗炎作用。另外，山姜素可能通過抑制TLR4調節NF-κB信號通路來發揮抗炎作用，從而抑制LPS誘導小鼠發生乳房炎[25]。從本試驗的結果來看，苜蓿黃酮降低了TLR2和MyD88基因表達和p38蛋白表達。結果說明，苜蓿黃酮可能通過抑制TLR2/MyD88/p38信號，降低炎癥因子的表達，從而達到抗炎癥的作用。

張宸豪等[26]研究發現，隨著LPS濃度增加，RAW264.7細胞內ROS的水平也增加。本試驗也發現，在LPS刺激下，細胞內的ROS濃度升高。鄧偉等[27]研究發現，橙皮素能夠抑制LPS誘導H9C2心肌細胞ROS產生，說明黃酮類物質具有降低細胞ROS濃度的功能。從本試驗結果來看，在LPS刺激下，苜蓿黃酮發揮抑制細胞內ROS產生的作用，這可能與其提高細胞抗氧化酶類活性有關。細胞內的ROS能夠與細胞膜的雙磷脂分子層及膜蛋白相結合，增加細胞膜通透性，導致DNA受損，進而促使細胞凋亡和死亡。Caspases家族中的大多數成員是開啟細胞凋亡的效應子，其中Caspase 3被認為是凋亡的關鍵蛋白酶，其一旦被激活，細胞凋亡就不可避免。從本試驗結果看，在LPS刺激下，苜蓿黃酮雖降低細胞Caspase-3蛋白的表達，但未達到顯著性差異，說明苜蓿黃酮對Caspase-3蛋白的表達影響不大。然而，在正常培養下，苜蓿黃酮顯著提高了細胞Caspase-3蛋白的表達，原因可能是苜蓿黃酮發揮了類雌激素作用，導致細胞氧化，提高ROS濃度所致。p53是一種抑癌基因，其主要功能是通過促進DNA修復蛋白的轉錄合成來完成DNA損傷的修復。當該修復無法完成時，p53會促使凋亡相關蛋白如Fas、Apaf-1、Bax等的表達，進而導致細胞凋亡。另外，p53能夠與Bcl-xL、Bcl-2的結合或者直接結合并激活Bak，誘導Bak寡聚，進而導致細胞色素C釋放和促進細胞凋亡。細胞內的ROS濃度增加，會促使p53基因表達升高，進而促進細胞凋亡[28]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是絲氨酸/蘇氨酸激酶高度相關的蛋白激酶超家族，其是細胞內一種重要的信號傳導系統，能夠被LPS所激活。p38MAPK能夠通過提高c-myc表達、磷酸化p53、參與Fas/Fasl介導的凋亡、誘導Bax轉位和增強TNF-α表達等來促進細胞凋亡[29]。從本試驗發現，在LPS刺激下，p53和p38蛋白的表達升高，而添加苜蓿黃酮能夠抑制它們的表達。說明在LPS刺激下，苜蓿黃酮可能通過降低細胞內的ROS濃度，抑制p53和p38蛋白的表達，進而抑制細胞的凋亡。

在LPS刺激下，苜蓿黃酮能夠降低奶牛乳腺上皮細胞內ROS的濃度，抑制p53和p38等凋亡蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡，提高細胞活性。另外，苜蓿黃酮可能通過抑制TLR2/MyD88/p38信號，進而降低TNF-ɑ、IL-1β和IL-6等炎癥因子基因的表達，從而發揮抗炎癥的作用。

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