甘農三號紫花苜蓿種帶細菌的生物功能分析及鑒定

張振粉，師尚禮

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

內生細菌與宿主植物在長期共同進化過程中形成互惠互利關系，在自然界中廣泛存在，現已從多種植物根、莖、葉、花、果實和種子中分離到[1-3]。植物內生細菌具有豐富的功能多樣性，可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)[4-6]、細胞分裂素(cytokinin, CTK)[7]，這有助于植物種子更早和更好的萌發。大部分內生細菌被證明它們可以固氮(nitrate fixtion)[4，8-10]，溶磷(phosphate solubilizing)[11-12]，分解纖維素(cellulose dissolving)[13-14]，幫助寄主植物更能適應貧瘠的土壤或生長環境；研究結果表明，內生細菌和寄主植物共生體提高了植物的抗寒、旱、鹽和重金屬的脅迫能力[15-16]；共生體的這種耐貧瘠和抗逆境脅迫能力，使其種群在自然生態系統中具有更強的生存和競爭優勢。內生細菌還可以防治植物病害并誘導植物抗病性，使寄主植物種群得到更好的保護和健康的繁衍[1]。植物內生細菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應用潛力，是潛力巨大且尚待開發的微生物新資源[4]。

毋庸置疑，種帶內生菌同種帶病原一樣，可通過儲存在時間上進行延續和通過商業、生產和科技交流等活動在空間上進行傳播[17]。種帶細菌可以在紫花苜蓿(Medicagosativa)種子存活達十年及以上，并具有活力[8，18]。大多數有花植物通過有性生殖和產生種子繁衍后代，植物種群的繁衍和生存與種子活力的保持和成功萌發成苗關系密切[19]，并決定植物進入自然和農業生態系統的時間，直接影響作物的產量[20-21]。

甘農三號紫花苜蓿(Medicagosativacv. Gannong No.3)由甘肅農業大學育成，經1995 年全國牧草品種審定委員會評審通過、登記注冊。它是通過引種國內外豐產品種，選擇優良單株，扦插成無性系，經過多元雜交和配合力測驗，由7個優良的無性繁殖系合成的綜合品種[22]。該品種耐瘠薄、抗旱、耐寒。春季返青較早，生長速度較快，再生能力較強，秋季休眠早。抗倒伏能力一般。是當前我國甘肅、青海、寧夏、新疆灌區主要推廣的品種。

本試驗采用稀釋平板法從表面消毒的甘農三號紫花苜蓿種子中分離種帶細菌，采用稀釋平板法從表面消毒的甘農三號紫花苜蓿種子中分離細菌，測定其產IAA、溶磷、固氮和分解纖維素生物學功能，并通過表型特征和16S rDNA基因序列分析鑒定其分類地位。本研究擬從甘農三號紫花苜蓿分離鑒定種帶功能細菌，為進一步開發利用生防制劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的甘農三號紫花苜蓿品種種樣于2014年7月從酒泉苜蓿種植區采集，并帶回甘肅農業大學牧草種質資源實驗室(蘭州)常溫保藏，于2015年9月開始種帶細菌分離試驗。

供試培養基：營養瓊脂培養基(nutrient agar，NA)用于種帶細菌的活化和保存，肉汁凍培養液(nutrient broth，NB)用于菌懸液的制備，金氏培養基B (King’s medium B，KB)用于菌株產IAA的測定[23]。Pikovaskaia培養基(PKO)用于菌株溶解無機磷的測定，蒙金娜培養基用于測定菌株溶解有機磷的能力，阿須貝無氮培養基用于固氮能力定性測定，纖維素剛果紅培養基用于分解纖維素能力的測定[14]。

供試標準枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，ACCC 10243)菌株購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC: Agricultural Culture Collection of China)。

1.2 種帶細菌的分離

將制備好的NA平板培養基，置培養箱中1～2 d后檢查，確認沒有污染方可使用。然后采用稀釋法分離培養。即分別稱取紫花苜蓿種樣1 g (約450粒)備用，將種子先用75%的乙醇浸泡2 min，后轉入1%的NaClO消毒5 min[24]，用無菌水沖洗3～4次轉至盛有10 mL無菌水和少量滅菌后的石英砂的研缽中研磨，靜置10 min后取上清液梯度稀釋到濃度為1～10-3，取4個稀釋度的菌懸液各200 μL涂布于 NA平板上；無菌蒸餾水接種為對照組；試驗重復3次。涂板后置于28 ℃恒溫培養3～5 d，根據菌落和產色素等形態特征分類劃線純化，觀察并描述菌落的形態、大小、光澤、質地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度、菌落及培養基的顏色等特征[23]，于背景布自然日光條件下拍照(Canon A720)；將純化后的菌種4 ℃短暫保存于NA斜面上。

1.3 種帶細菌的生物功能測定

1.3.1產IAA 能力 標準曲線采用純3-IAA制作。將經 KB培養液培養12 d的菌懸浮液和空白對照離心(4 ℃，10000 r·min-1，10 min)， 取上清液4 mL加等量比色液，在黑暗中靜置30 min，立即測定OD530 nm值，重復測3次，以加比色液的空白對照調0[25]。根據標準曲線計算出內生細菌分泌IAA的量。

1.3.2溶磷能力 將內生細菌接于PKO或蒙金娜培養基平板上，每皿接5點， 重復3次，置于28 ℃恒溫培養箱培養，觀察并測量菌株在培養基平板上形成的溶磷圈大小[26]。根據溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d值)確定內生細菌的溶磷能力。

1.3.3固氮能力 經活化的供試菌株用無菌生理鹽水配制菌懸液，以200 μL分別涂板接種于阿須貝無氮固體培養基和液體培養基內，3次重復，以接種無菌水為對照，28 ℃培養(150 r·min-1)，在第3和7天目測其生長狀況，平板上生長菌落和三角瓶內培養基變渾濁者為陽性[25]。

1.3.4分解纖維素能力 將活化培養48 h的菌株點接于纖維素剛果紅培養基上，置于30 ℃恒溫培養3 d。在菌株的觀察過程中記錄透明圈的直徑大小(D)和菌落的直徑大小(d)，計算酶相對活性(A)=D/d[27]。

1.4 細菌鑒定

1.4.1生理生化特征 參照文獻[28-30]，進行部分菌株的革蘭氏染色、產芽孢、需厭氧生長、硝酸鹽還原、最大耐鹽性和利用碳源產酸等生理生化特征測定。

1.4.216S rDNA基因序列分析鑒定 種帶細菌16S rDNA基因序列擴增引物為通用引物27F/1492R，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；擴增和檢測方法等具體參考文獻[31]，與GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih-gov/blast.cgi)中序列相似性比較，并用Clustal (1.8)軟件進行多重序列比較和用Mega (4.0)軟件鄰接法構建系統發育樹，確定其系統發育學地位。

2 結果與分析

2.1 種帶細菌多樣性

從表面消毒的甘農三號紫花苜蓿種子中分離得到8種細菌分離物(ZSR9～16)，NA平板上48 h后的菌落形態特征詳見圖1。8種細菌分離物的菌落形態和產色素均有一定的差異，表明甘農三號紫花苜蓿種帶可培養細菌具有多樣性。

圖1 甘農三號紫花苜蓿種帶細菌分離物ZSR9～16的菌落形態Fig.1 The colony shape of seed-borne bacterial strains on NA medium of lucerne cultivar Gannong No.3

ZSR9：菌落乳頭狀凸起，近圓形，肉色，稍有光澤，表面褶皺，邊緣不整齊，不透明，略有粘度，直徑2～4 mm；ZSR10：菌落具有中凹的隆起，圓形或近圓形，乳白色，稍有光澤，邊緣不整齊，半透明，略有粘度，直徑2～3 mm；ZSR11：菌落稍凸起的，圓形或近圓形，白色，略顯米黃，稍有光澤，邊緣不整齊，不透明，略有粘度，直徑2～6 mm；ZSR12：菌落凸起的，圓形或近圓形，肉色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑1～5 mm；ZSR13：菌落稍凸起的，圓形或近圓形，黃色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑1～4 mm；ZSR14：菌落凸起的，圓形或近圓形，奶白色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm；ZSR15：菌落凸起的，不規則形，表面有褶皺，灰褐色，有光澤，邊緣不整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm；ZSR16：菌落平展，圓形或近圓形，白色，有光澤，邊緣整齊，半透明，有粘度，直徑2～4 mm。

2.2 種帶細菌功能多樣性

對種帶細菌進行產IAA、溶磷、固氮和分解纖維素能力測定結果表明(表1)，8個菌株均具有產IAA的能力，最強的是ZSR9，在添加色氨酸的培養基上分泌IAA的量達4.26 mg·L-1；有7個菌株具有分解纖維素的能力，占總株數的87.5%，ZSR9的能力最強；有7個菌株具有固氮能力，占總株數的87.5%；7個菌株具有同時溶解有機磷和無機磷的能力，占總株數的87.5%，且它們溶解無機磷均強于溶解有機磷的能力；其中ZSR9菌株對兩種磷溶解能力最強。在已測得的8株種帶細菌都具有生物功能，其中7株細菌：ZSR9～12、ZSR14～16同時具有分泌IAA、溶磷、固氮和分解纖維素的能力，ZSR9各個生物功能的能力顯著(P<0.05)高于其他7種菌。

-：無功能Without biological function；+：有功能With biological function；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters in the same column denote significant difference (P<0.05).

2.3 種帶細菌的鑒定

2.3.1生理生化測定 部分甘農三號紫花苜蓿種帶細菌分離物(ZSR9～12、ZSR14～15)和標準菌株ACCC 10243的主要細菌學特征見表2，根據標準菌株的生長形態特征以及部分生理生化指標開展對種帶細菌分離物的表型鑒定。ZSR9與標準菌株ACCC 10243表型特征一致，結合形態特征初步確定其為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；ZSR11與標準菌株ACCC 10243非常接近，但是ZSR11能耐受50 ℃高溫，區別于標準菌株，結合形態特征初步確定其為莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)；ZSR10和ZSR14的表型特征比較接近，但在纖維醇、麥芽糖和松二糖中的產酸卻表現不同，它們與標準菌株在明膠水解、硝酸鹽還原、耐鹽性和生長溫度范圍存在差異，結合形態特征初步確定ZSR10為沙福芽孢桿菌(B.safensis)；ZSR14為短小芽孢桿菌(B.pumilus)；ZSR12在厭氧生長、利用丙酸鹽、生長溫度范圍、耐鹽性和在松二糖中產酸區別于標準菌株，結合形態特征初步確定其為地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)；ZSR15在NA培養基上產生暗褐色色素、生長溫度范圍、耐鹽性、在纖維醇和松二糖中的產酸特征與ACCC 10243存在差異，結合形態特征初步確定其為萎蔫芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

表2 甘農三號紫花苜蓿種帶細菌分離物的表型特征Table 2 Phenotypic characteristics of bacterial strains isolated from seeds of lucerne cultivar Gannong No.3

1：BacillussubtilisACCC 10243；2：ZSR9；3：ZSR10；4：ZSR11；5：ZSR12；6：ZSR14；7：ZSR15； +：陽性Positive reaction；-：陰性Negative reaction；DB：暗褐色Dark brown.

2.3.216S rDNA鑒定 8株可培養紫花苜蓿種帶細菌成功提取其基因組DNA并擴增出16S rDNA序列。經16S rDNA序列相似性分析和構建系統發育分析(圖2)，表明甘農三號紫花苜蓿種帶細菌分屬3個屬，它們分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、土地芽孢桿菌屬(Terribacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)。8株細菌分離物在NCBI的BLASTN與其16S rDNA序列同源性高達99%～100%。ZSR9和ZSR11與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)和太陽海岸芽孢桿菌(B.axarquiensis)聚為一類；ZSR10與沙福芽孢桿菌(B.safensis)聚為一類；ZSR12與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)聚為一類；ZSR13與腸桿菌屬(Enterobactersp.)聚為一類；ZSR14與短小芽孢桿菌(B.pumilus)聚為一類；ZSR15與深褐芽孢桿菌(B.atrophaeus)聚為一類；ZSR16與土地芽孢桿菌屬(Terribacillussp.)聚為一類；表明在系統發育上其親緣關系較近。

圖2 甘農三號紫花苜蓿種帶細菌的16S rDNA系統發育樹Fig.2 16S rDNA sequence phylogenetic tree of seed-borne bacteria isolated from lucerne of Gannong No.3 括號內為 GenBank 登錄號Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank；分支點上的數字為自展值百分比The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap.

3 討論與結論

本試驗首次證實甘農三號紫花苜蓿的種帶細菌具有多樣性，從甘農三號紫花苜蓿種子中分離、純化出8株細菌(ZSR9～16)，通過對這8株菌的菌體形態描述、生理生化特征和16S rDNA鑒定，它們分別屬于3個屬的8種菌。其中芽孢桿菌屬(Bacillus)的有6株：枯草芽孢桿菌(B.subtilis) ZSR9、沙福芽孢桿菌(B.safensis) ZSR10、莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis) ZSR11、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis) ZSR12、短小芽孢桿菌(B.pumilus) ZSR14和深褐芽孢桿菌(B.atrophaeus) ZSR15；以及屬于腸桿菌屬(Enterobacter)的ZSR13和屬于土地芽孢桿菌屬(Terribacillus)的ZSR16。芽孢桿菌屬(Bacillussp.)廣泛地存在于自然界，在土壤、水、空氣、極端環境中和紫花苜蓿種子均存在[18，28]。福芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌首次于紫花苜蓿種子中分離得到。腸桿菌屬(Enterobactersp.)廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、紫花苜蓿種子等植物中均可檢出[18，32]。土地芽孢桿菌屬(Terribacillussp.)首次于農田土壤中分離得到[33]，又陸續從動物、西沙野生諾尼和煙草(Nicotianatabacum)等植物檢測出[34-36]。其中土地芽孢桿菌屬是首次分離自紫花苜蓿種子豐富了該屬細菌的生境分布。

本試驗分離得到6種芽孢桿菌(ZSR9～12和ZSR14～15)，它們具有功能多樣性，均能產IAA、溶磷、固氮和分解纖維素，枯草芽孢桿菌ZSR9的所有功能的能力最強，該結果與已有研究結果一致[14，37-39]。已有研究表明，芽孢桿菌與自然界物質轉化、土壤肥力、環境衛生均密切相關，許多能水解淀粉，分解蛋白質、果膠、藻酸鹽等，工業上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[18]；它們有的還可以產生抗菌素，可以抑制病原菌的發生擴展[40-42]，本試驗未對此類功能進行進一步研究，有待深入研究。生理生化指標測定顯示，這6種菌具有較強的耐鹽性和較寬的生長溫度范圍，最高能耐受10% NaCl和5～55 ℃，表明分離自甘農三號紫花苜蓿的6株芽孢桿菌具有耐瘠薄、耐寒、耐高溫等屬性。芽孢桿菌屬里的大部分細菌都具有較高的耐鹽性和較寬的生長溫度范圍，本研究結果與其一致[28]。菌株腸桿菌屬ZSR13具有較弱的產IAA能力；菌株土地芽孢桿菌ZSR16具有功能多樣性，具有較強的產IAA、溶磷、固氮和分解纖維素的能力；表明這兩菌株是對甘農三號紫花苜蓿有利的。這些菌種的得到將為下一步將其作為生防菌種資源的開發利用奠定基礎。

甘農三號紫花苜蓿與種帶細菌是互惠互利的共生體，種帶細菌可以幫助寄主適應瘠薄、寒冷等逆境，從而更健康的生長和繁殖；而紫花苜蓿給它提供穩定的寄生場所及生長繁殖所需的營養。因此，有益微生物的種類和數量的多少，是評價與其共生寄主的品質重要指標之一。本研究僅利用傳統培養方法進行種帶細菌的培養，不能充分展示甘農三號紫花苜蓿微生物的多樣性。文獻[43]報道用分子非培養手段從未感染Clavibactermichiganensissubsp.insidiosus的苜蓿種樣中檢測到其他32種種帶細菌。因此，有必要探索模擬更接近種帶細菌其營養需求及真實的生存環境，分離培養更豐富的有益細菌資源，為進一步的開發利用提供理論基礎。當然，許多研究已證實通過傳統的分離方法鑒定的微生物只占環境微生物總數的0.1%～10%，且一部分植物內生細菌由于人工環境不適宜而不能進行繼代培養[4，44]。因此，也有必要利用非培養方法對其組織內非可培養其他種帶細菌進行更詳細的研究，從而更真實地了解其細菌多樣性及其功能。

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